汉黄芩素调控胆绿素还原酶A 对结肠癌细胞的抑制作用

毛海燕 殷旭东 乔大伟 孔桂美 卜 平*

（1.扬州大学附属医院肿瘤科，江苏 扬州225000； 2.扬州大学医学院中西医结合系，江苏 扬州225009）

结直肠癌是消化道系统常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率、高死亡率的特点。据统计，结直肠癌在中国乃至世界范围内发病率居于第三，死亡率居于第二［1］。对于晚期结直肠癌患者，许多患者不能耐受化疗，传统的中医药治疗显现出优势。研究发现许多中药复方及中药单体都具有抗肿瘤活性，本课题组前期发现结肠癌术后患者脾虚湿毒证较多，自拟健脾解毒方，采用高效液相色谱检测发现验方健脾解毒方的主要活性单体为汉黄芩素。汉黄芩素是从中药黄芩中提取出来的一种黄酮类成分，近年来，国内外研究发现汉黄芩素在胰腺癌［2］、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤中都表现出明显的抗肿瘤活性及抗血管生成［3⁃6］作用，在恶性肿瘤的防治方面具有广阔的应用前景。胆绿素还原酶A（Biliverdin reductase A，BLVRA）是一种进化上高度保守的可溶性NADH 依赖酶，广泛分布于动植物细胞浆内［7］，是胆绿素代谢的限速酶，能够促进胆绿素向胆红素转化，维持细胞内氧化还原反应的动态平衡，其调节细胞的生长和增殖，在人类肿瘤中，其在转录和蛋白质水平的表达增加，从而促进肿瘤生长。

1 材料

1.1 细胞株 人结肠癌细胞株LOVO、SW620、HCT116、SW480、HT29 和正常肠上皮细胞FHC 购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物及试剂 汉黄芩素（上海阿拉丁生化科技有限公司，批号632⁃85⁃9，纯度＞99.8%）；5⁃FU（武汉百浩天生物科技有限公司，批号H31020593）；DMEM、RPMI⁃1640及F⁃12K细胞培养基（美国Gibco 公司，批号分别为AE2944968、AE29456629、AE2944653）；胎牛血清（美国Gibco 公司，批号42F6590 K）；胰蛋白酶⁃乙二胺四乙酸（EDTA）混合液（美国Gibco 公司，批号1665746）；MTT试剂盒（武汉百浩天生物科技有限公司，批号H152440）；Annexin V⁃异硫氰酸荧光素（FITC，美国BD 公司，批号B148219）；碘化丙碇（PI，美国BD 公司，批号25535）；NaOH（上海国药集团化学试剂有限公司，批号10019764）；Trizol 总RNA 提取试剂（美国Invitrogen 公司，批号9108）；蛋白裂解试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号P6730）；BCA 蛋白定量试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号RK242682）；逆转录⁃聚合酶链式反应（RT⁃PCR）及实时荧光定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司，批号RR820 A、RR036 A）；所用的PCR 引物BLVRA和GAPDH由上海金斯顿生物技术公司合成；BLVRA、E⁃cadherin、Vimentin、snail、Bcl⁃2、BAX、GAPDH 一抗和羊抗兔辣根过氧化酶（HRP）二抗（美国CST 公司，批号依次为393385、3195、5741、3879、4223、2772、MS01）；人工基底膜（Matrigel）（美国BD 公司，批号356234）；穿透小室（Transwell，美国Corning 公司，批号3422）。

2 方法

2.1 细胞培养 实验用所有细胞株均培养于含10%胎牛血清，100 U／mL 青链霉素的培养液中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养，至细胞处于对数生长期时进行下一步实验。

2.2 MTT 检测细胞增殖能力 根据细胞筛选结果，取对数生长期HT29 和SW620细胞作为目的细胞，细胞浓度为1×105／mL 的细胞悬液，每孔100 μL 接种于96 孔板，37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h 后加入不同质量浓度（0、20、40、80、160 μg／mL）［8］汉黄芩素溶液（0.4% NaOH 溶解）及12.5 μg／mL 的5⁃FU，每组设5个复孔，分别培养24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL），培养4 h 后加入150 μL DMSO，摇床摇动10 min，酶标仪测定490 nm 的吸光度值（OD）。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 6 孔板培养HT29 及SW620细胞，经不同质量浓度汉黄芩素（0、20、40、80、160 μg／mL）及12.5 μg／mL 5⁃FU 处理，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h 后，收集上液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后弃去上清，胰酶消化收集2×105个细胞，100 μL 结合缓冲液重悬，加入400 μL PBS，按照试剂盒说明书方法，室温下每管加入PI 染液5 μL，Annexin V⁃FITC 10 μL，避光孵育15 min 后流式细胞仪检测，根据公式计算细胞凋亡率。细胞凋亡率＝（凋亡的细胞数／总细胞数）×100%。

2.4 Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力 按1∶8 比例稀释Matrigel 胶，加入60 μL Matrigel 胶稀释液包被、水化Transwell 小室底部膜，放37 ℃培养箱过夜，迁移能力检测不加Matrigel 胶。无血清培养液将细胞浓度调整至4×105／mL，加200 μL 到上室，下室加入含20% 胎牛血清的培养液500 μL。分别不同终质量浓度汉黄芩素（0、20、40、80、160 μg／mL）及12.5 μg／mL 5⁃FU 处理细胞，每种浓度设3个复孔，细胞培养24 h 后，取出Transwell 小室，PBS 漂洗3 次，棉签小心擦去上室表面细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色30 min，在高倍镜下计数小室膜下面侵袭的细胞数，计数中间和四周5个视野，取平均值。

2.5 RT⁃PCR 检测BLVRAmRNA 的表达 不同质量浓度汉黄芩素（0、20、40、80、160 μg／mL）及12.5 μg／mL 5⁃FU 处理HT⁃29 和SW620细胞24 h，收集细胞，Trizol 提取总RNA 并进行cDNA 合成，RT⁃PCR 检测BLVRAmRNA 表达。引物序列，BLVRA正向 5′⁃GGAATCCACACCCTT CCTCA⁃3′，反向5′⁃CTTGGCTGGAAAGAGCATCC⁃3′；GAPDH正向5′ ⁃CACCCACTCCTCCACCTTTG⁃3′，反向5′⁃CCACCACCCTGTTG CTGTAG⁃3′。反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃持续10 s，60 ℃、34 s，72 ℃、10 s，40个循环，计算2－ΔΔCT用于分析基因的相对表达。

2.6 Western blot 检测BLVRA 蛋白及EMT 和细胞凋亡相关蛋白表达 将2×105个HT29 和SW620细胞种植于6 孔板，培养24 h 后加入不同质量浓度汉黄芩素（0、20、40、80、160 μg／mL）及12.5 μg／mL 5⁃FU 继续培养24 h，弃培养液，PBS 漂洗3 次，加入蛋白裂解混合液（Lysis Buffer 1 mL，10 μL 磷酸酶抑制剂，1 μL 蛋白酶抑制剂和5 μL 100 mmol／L PMSF 提取全蛋白，整个过程在冰上操作。BCA法测定蛋白浓度，步骤按说明书进行。蛋白样品20 μg 进行多聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳液，5% BSA 室温摇床封闭2 h后加入一抗4 ℃孵育过夜，用洗膜缓冲液（TBST）摇床洗涤3 次，10 min／次，二抗室温孵育1.5 h，再用TBST 缓冲液摇床洗涤3 次，10 min／次，超敏化学发光试剂（ECL）发光，采集图像后ImageJ分析数据，实验重复3 次。

2.7 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学处理分析，计量资料采用（）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞筛选结果 RT⁃PCR 及Western blot 检测结果显示，五株结肠癌细胞中BLVRA 表达均高于FHC细胞（P＜0.05，P＜0.01），筛选出BLVRA 低表达的SW620细胞和高表达的HT29细胞进行后续实验。见图1。

图1 不同细胞株BLVRA 表达（， n＝3）

3.2 汉黄芩素抑制结肠癌HT29 和SW620细胞的增殖能力 与空白组比较，随着汉黄芩素浓度的增高，汉黄芩素处理HT29 及SW620细胞24、48、72 h，细胞增殖能力降低（P＜0.05，P＜0.01），其抑制效应随着作用浓度及作用时间的延长逐渐增加；与5⁃FU组比较，汉黄芩素（160 μg／mL）组在72 h 时对HT⁃29细胞抑制作用明显（P＜0.01），而汉黄芩素（160 μg／mL）组在48 h 及72 h 时对SW620细胞抑制作用明显（P＜0.01）。见表1～2。

表1 汉黄芩素抑制HT29细胞的增殖作用（， n＝5）

表1 汉黄芩素抑制HT29细胞的增殖作用（， n＝5）

注：与空白组（0 μg／mL）比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与5⁃FU组比较，＃＃P＜0.01。

表2 汉黄芩素抑制SW620细胞的增殖作用（， n＝5）

表2 汉黄芩素抑制SW620细胞的增殖作用（， n＝5）

注：与空白组（0 μg／mL）比较，**P＜0.01；与5⁃FU组比较，＃＃P＜0.01。

3.3 不同浓度汉黄芩素能促进结肠癌HT29 和SW620细胞凋亡 与空白组比较，汉黄芩素对HT29 及SW620细胞的促凋亡作用随着药物浓度的增加而增强（P＜0.01），与5⁃FU组相比，汉黄芩素（80、160 μg／mL）组对HT29细胞的促凋亡作用优于5⁃FU组（P＜0.05，P＜0.01），汉黄芩素160 μg／mL组对SW620细胞的促凋亡作用更好（P＜0.01），而汉黄芩素低浓度组促凋亡作用劣于5⁃FU组，见图2～3。

图2 汉黄芩素对HT⁃29细胞凋亡的影响（， n＝3）

图3 汉黄芩素对SW620细胞凋亡的影响（， n＝3）

3.4 不同浓度汉黄芩素对结肠癌HT29、SW620 凋亡相关蛋白Bcl⁃2、BAX 的影响 与空白组比较，HT29细胞中汉黄芩素（40、80、160 μg／mL）组Bcl⁃2 表达逐渐下降，而BAX 的表达逐步升高（P＜0.01）；与5⁃FU组比较，汉黄芩素（160 μg／mL）作用明显（P＜0.01）。SW620细胞中随着汉黄芩素浓度的增加，Bcl⁃2 表达逐渐下降（P＜0.01），而BAX 的表达逐步升高（P＜0.05，P＜0.01），与5⁃FU组比较，汉黄芩素（160 μg／mL）组Bcl⁃2 的表达降低（P＜0.05），汉黄芩素（80、160 μg／mL）组BAX 的表达差异明显（P＜0.05，P＜0.01）。见图4～5。

图4 汉黄芩素对HT⁃29细胞凋亡相关蛋白表达的影响（， n＝3）

图5 汉黄芩素对SW620细胞凋亡相关蛋白表达的影响（， n＝3）

3.5 不同浓度汉黄芩素对结肠癌HT29 和SW620细胞迁移和侵袭能力的影响 与空白组比较，随着汉黄芩素浓度的升高，HT29细胞迁移和侵袭能力逐渐下降（P＜0.01）；与5⁃FU组比较，汉黄芩素（80、160 μg／mL）组抑制作用更明显（P＜0.05，P＜0.01）。与空白组比较，随着汉黄芩素浓度的升高，SW620细胞迁移和侵袭能力逐渐下降（P＜0.05，P＜0.01）；与5⁃FU组比较，汉黄芩素（160 μg／mL）组抑制作用更明显（P＜0.01）。见图6～9。

图6 汉黄芩素对结肠癌HT29细胞迁移能力的影响（×100）（n＝3）

图7 汉黄芩素对结肠癌HT29 侵袭能力的影响（×100）（n＝3）

图8 汉黄芩素对结肠癌SW620细胞迁移能力的影响（×100）（n＝3）

图9 汉黄芩素对结肠癌SW620细胞侵袭能力的影响（×100）（n＝3）

3.6 不同浓度汉黄芩素对结肠癌HT29 和SW620细胞EMT相关蛋白的影响 与空白组比较，汉黄芩素（40、80、160 μg／mL）促进HT29细胞E⁃cadherin 表达，对snail 的抑制作用逐渐增强（P＜0.01），汉黄芩素（20、40、80、160 μg／mL）对Vimentin 的抑制作用逐渐增强（P＜0.05，P＜0.01）；与5⁃FU组比较，汉黄芩素（160 μg／mL）对Vimentin 及snail 抑制作用更明显（P＜0.05），其对E⁃cadherin 促进作用与5⁃FU组相似。与空白组比较，汉黄芩素（40、80、160 μg／mL）促进SW620细胞E⁃cadherin 表达（P＜0.05，P＜0.01），汉黄芩素（20、40、80、160 μg／mL）对Vimentin 及snail 的抑制作用逐渐增强（P＜0.05，P＜0.01）；与5⁃FU组比较，汉黄芩素（80、160 μg／mL）对E⁃cadherin 的促进作用及snail抑制作用明显（P＜0.05），汉黄芩素（160 μg／mL）对Vimentin 的抑制作用更优（P＜0.05）。见图10～11。

图10 汉黄芩素对结肠癌HT29细胞EMT 相关蛋白的影响（， n＝3）

图11 汉黄芩素对结肠癌SW620细胞EMT 蛋白的影响（， n＝3）

3.7 不同浓度汉黄芩素对BLVRA 蛋白的影响 与空白组比较，汉黄芩素（40、80、160 μg／mL）可抑制HT29细胞BLVRA 蛋白的表达（P＜0.05，P＜0.01），而在SW620细胞中，随着汉黄芩素浓度的升高，对BLVRA 的抑制作用越来越强（P＜0.01）；与5⁃FU组比较，HT29细胞中汉黄芩素（80、160 μg／mL）对BLVRA 的抑制作用优于5⁃FU组（P＜0.01），而在SW620细胞中汉黄芩素显现出与5⁃FU 类似的抑制作用（P＞0.05）。见图12～13。

图12 汉黄芩素对结肠癌HT29细胞BLVRA 蛋白的影响（， n＝3）

图13 汉黄芩素对结肠癌SW620细胞BLVRA 蛋白的影响（， n＝3）

4 讨论

结直肠癌是我国乃至全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，随着饮食习惯及生活环境的变化，在我国结肠癌的发病率及死亡率逐年升高，且发病年龄呈现年轻化趋势［9］。虽然越来越多的新型抗肿瘤药及免疫治疗药物问世，但结直肠癌的治疗效果仍不理想。近年来，多种中药活性提取物在多种恶性肿瘤的进展中显现出明显的抗肿瘤作用，成为肿瘤治疗的研究热点。本课题组成员前期研究已经发现半枝莲提取物及其含药血清可抑制肿瘤细胞的增殖和血管生成［10］。肿瘤细胞增殖、细胞凋亡以及肿瘤细胞迁移和侵袭是结直肠癌进展的关键步骤。汉黄芩素是从传统中药黄芩中提取的一种黄酮类化合物，研究表明其可以通过调节肝脏干细胞的增殖和凋亡来减轻肝纤维化［11］，多项研究发现汉黄芩素具有广谱的抗肿瘤活性，能够诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、减少肿瘤新生血管形成，同时还可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［12⁃14］。本研究结果显示汉黄芩素能够抑制结肠癌细胞系HT⁃29 及SW620细胞的增殖，且呈现出浓度和时间依赖性，同时汉黄芩素能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，且呈现出剂量浓度依赖性，这一研究结果与李瑶瑶等［15］及樊帅君等［16］研究结果类似。由此可见，汉黄芩素对在结直肠癌细胞的发生发展中起着重要的抑制作用。Bcl⁃2 和BAX 是细胞凋亡通路的必需因子，BAX 存在于细胞质中，能转入到线粒体外膜，从而诱导细胞凋亡，而Bcl⁃2 能抑制BAX 的转入从而抑制细胞凋亡［17］，因此BAX 扮演着促凋亡角色，而Bcl⁃2 则起着相反的作用，两者的比例决定着细胞凋亡的方向。本研究显示随着汉黄芩素浓度的提升，BAX 的表达水平呈上升趋势，而Bcl⁃2 的表达水平则呈下降趋势，明显促进肿瘤细胞的凋亡。上皮⁃间质转化（EMT）在肿瘤的复发和转移中也起着重要作用，所有的EMT 亚组都显现出相似的促进肿瘤细胞增殖的能力［18］。E⁃cadherin 在细胞与细胞之间的粘附过程中起着重要作用，其表达水平的下降是EMT 进程和细胞迁移的基本因素。Vimentin 被认为是细胞间质转化的一个典型标志，snail 是恶性肿瘤侵袭转移过程中诱导EMT 过程的关键作用因子之一，在肿瘤EMT 进程中Vimentin 及snail 的表达是上调的［19］。本研究结果发现，汉黄芩素能够促进E⁃cadherin 的表达，抑制Vimentin 及snail的表达水平，且随着剂量浓度的提高其作用更明显，提示汉黄芩素可抑制结肠癌细胞的EMT 进程，从而抑制结肠癌进展。

胆绿素还原酶A（Biliverdin reductase A，BLVRA）是胆绿素还原酶（Biliverdin reductase，BVR）的一个主要亚型，是一种有效的抗氧化剂，能够促进胆绿素向胆红素转化［20］，能作为细胞内转运蛋白来调节肿瘤细胞的生长和增殖。其在多种肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等肿瘤中呈现过表达水平［21⁃23］，促进肿瘤的发生发展过程。BLVRA 的过表达能够影响上千种基因、信号通路、细胞凋亡及免疫分子水平的表达，但是BLVRA 在结直肠癌中的作用尚未被研究，且汉黄芩素对其作用亦未得到研究。本研究结果显示汉黄芩素作用结肠癌细胞24 h 后能够抑制BLVRA 的表达，且显现出剂量浓度依耐性。随着BLVRA表达水平的下降，细胞增殖及细胞侵袭和迁移能力下降，细胞凋亡作用提高，而肿瘤的EMT 进程也明显被抑制，表明汉黄芩素通过调控BLVRA 的表达水平可能是其发挥抑制结肠癌进展的作用机制之一。

综上所述，汉黄芩素能够通过调控BLVRA 的表达来有效抑制结肠癌细胞的进展，在结肠癌的防治中有一定疗效，但其是否可通过其他信号通路及靶点来发挥抑制作用，且在体内是否有相似的抗肿瘤作用仍需进一步深入研究。