丹酚酸B 抑制波动高糖诱导的糖尿病大鼠心肌细胞凋亡

赵梦秋 任尤楠 陶善珺 郑书国*

（1.安徽卫生健康职业学院药学教研室，安徽 池州247009； 2.皖南医学院药理教研室，安徽 芜湖241002）

糖尿病及其心血管并发症的发病率和致死率近年来持续上升，是威胁人类健康的一大杀手［1］。糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM）是糖尿病的一种严重的心血管并发症，疾病早期就能观察到结构与功能障碍［2］，心肌细胞凋亡是其主要的病理特征之一。DCM 的发病机制尚未完全阐明，多种因素如高血糖、胰岛素抵抗、代谢紊乱等可通过氧化应激、内质网应激、钙调节受损、线粒体功能障碍等各种途径促使心肌细胞凋亡［3］，其中高血糖发挥关键作用。此外，血糖波动可能是糖尿病患者早期心功能异常的危险因素［4］，血糖波动可引起比持续高糖更严重的慢性并发症，如心肌细胞产生氧化应激损伤，使心肌细胞凋亡增加［5］。

作为传统中药丹参中提取出来的一种活性化合物，丹酚酸B 的心脏保护作用在多种模型上得到验证［6⁃7］。然而丹酚酸B 是否能够减轻波动高血糖造成的心脏损伤，延缓DCM 进程尚不清楚。本实验在糖尿病大鼠模型上通过人工干预造成一日内血糖水平大幅波动，并观察丹酚酸B 对心肌细胞凋亡的影响。

1 材料

1.1 动物与饲料 雄性SD 大鼠，体质量220～240 g，购于浙江省实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（浙）2014⁃0001；高糖高脂饲料（含猪油10%、蔗 糖10%、蛋黄粉5%、胆固醇1%、普通饲料74%），购于南京市青龙山实验动物中心。

1.2 药物与试剂 丹酚酸B（纯度80%，HK201410），购于西安文竹生物科技有限公司；链脲佐菌素（STZ，1126C028），购于美国 Sigma 公 司；普通胰岛素（2141D2D9），购于江苏万邦生化医药股份有限公司；Bcl⁃2一抗（AF6139）、Bax 一抗（AF0120），购于上海玉博生物科技有限公司；β⁃actin 抗体（ab8226）购于英国Abcam 公司；二抗（DXWB048）、蛋白定量试剂盒（DXWB010）购于上海代轩生物科技有限公司；天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（caspase）3 检测试剂盒（CK⁃E30186R）、磷酸肌酸激酶（CK⁃MB）试剂盒（CK⁃E90320R）购于苏州卡尔文生物科技有限公司；TUNEL 检测试剂盒（11684817910）购于瑞士罗氏公司；其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器 血糖仪购于长沙三诺生物传感技术有限公司；全功能发光仪器购于上海复日科技有限公司；酶标仪购于北京普朗新技术有限公司；高速离心机购于杭州奥盛仪器有限公司；电泳仪、转膜仪购于北京六一仪器厂；荧光显微镜购于日本尼康公司。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠血糖波动模型制备与给药 适应性喂养1周后，随机选取10 只大鼠作正常组，喂以普通饲料，其余大鼠给予高糖高脂饲料。4 周后，禁食12 h，按40 mg／kg一次性腹腔注射STZ 制备糖尿病模型。继续喂养7 d 后以随机血糖≥16.7 mmol／L 为模型制备成功。将糖尿病大鼠随机分为模型组、丹酚酸B 高剂量组及丹酚酸B 低剂量组。模型组和丹酚酸B 给药组继续喂饲高脂饲料，于每日8∶00 及18∶00 检测血糖值，并根据血糖水平，选择皮下注射普通胰岛素6～9 U（随机血糖≥16.7 mmol／L）或灌胃给予葡萄糖2 g／kg（随机血糖＜16.7 mmol／L），造成1 日内血糖水平大幅度波动模型［8］。丹酚酸B 给药组同时灌胃给予丹酚酸B 160 mg／kg 和80 mg／kg，连续6 周。

2.2 大鼠空腹血糖及血糖波动水平检测 参考文献［9］。实验结束前检测一日内各组大鼠8：00、12：00、16：00、18：00 和20：00 血糖值计算最大血糖波动幅度（LAGE），禁食12 h 后测定空腹血糖。

2.3 心肌细胞凋亡检测 实验结束后，戊巴比妥钠（30 mg／kg）麻醉，腹主动脉取血，取出心脏。取相同部位心肌组织常规石蜡包埋、切片，EDTA 抗原修复缓冲液微波抗原修复，10%兔血清封闭后按TUNEL 试剂盒要求加入凋亡检测反应液，DAPI 染液复染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片。切片于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

2.4 生化指标检测分离血清，按试剂盒说明书检测大鼠CK⁃MB 水平。取心肌组织制备10%组织匀浆，按试剂盒说明书测定caspase⁃3，BCA 法测定蛋白浓度。

2.5 心肌组织Bcl⁃2、Bax 蛋白表达检测 RIPA 裂解液提取心肌组织总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭后依次加入一抗及二抗孵育，ECL 显色，全功能发光仪检测分析结果。以与内参蛋白光密度的比值作为蛋白的相对表达量。

2.6 统计学分析 采用DAS 1.0 统计软件进行分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK⁃q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 丹酚酸B 对大鼠空腹血糖和最大血糖波动幅度的影响 由表1 可见，模型组大鼠空腹血糖及最大血糖波动幅度较正常组大鼠均升高（P＜0.01），表明糖尿病血糖波动模型造模成功。丹酚酸B 给药组大鼠空腹血糖比模型组大鼠降低（P＜0.05，P＜0.01），但对血糖波动无明显影响。

表1 丹酚酸B 对大鼠空腹血糖及最大血糖波动幅度的影响（， n＝7）

表1 丹酚酸B 对大鼠空腹血糖及最大血糖波动幅度的影响（， n＝7）

注：与正常组比较，** P ＜0.01；与模型组比较，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 丹酚酸B 对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响图1 为TUNEL 法检测各组大鼠心肌细胞凋亡图片。DAPI 染色细胞核，显示蓝色荧光，FICT 显示绿色荧光，该荧光提示细胞凋亡。图片显示正常组大鼠心肌细胞凋亡极少，糖尿病大鼠心肌细胞凋亡数量最多，丹酚酸B 给药组大鼠心肌细胞凋亡减少。

图1 丹酚酸BP 对大鼠心肌细胞凋亡的影响（TUNEL， ×200）

3.3 丹酚酸B 对糖尿病大鼠血清CK⁃MB 水平影响 如图2 所示，糖尿病大鼠血清CK⁃MB 水平较正常组升高（P＜0.01），说明波动高糖造成了糖尿病大鼠心肌细胞损伤。丹酚酸B 给药组血清CK⁃MB 水平降低（P＜0.01），提示丹酚酸B 可减轻糖尿病大鼠心肌细胞损伤。

图2 丹酚酸B 对大鼠血清CK⁃MB 水平的影响（n＝7）

3.4 丹酚酸B 对糖尿病大鼠心肌组织caspase⁃3 表达的影响 糖尿病大鼠心肌组织caspase⁃3 表达比正常组升高（P＜0.01），而丹酚酸B 给药后上述指标降低（P＜0.01），见图3。

图3 丹酚酸B 对大鼠心肌组织caspase⁃3 水平的影响（n＝7）

3.5 丹酚酸B 对糖尿病大鼠心肌组织Bcl⁃2、Bax 蛋白表达的影响 如图4 所示，糖尿病大鼠心肌组织Bcl⁃2 蛋白表达比正常组减少，而Bax 蛋白表达增加（P＜0.05，P＜0.01），丹酚酸B 给药能够改善这种趋势（P＜0.05，P＜0.01）。

图4 丹酚酸B 对大鼠心肌组织Bcl⁃2 及Bax蛋白表达的影响（n＝3）

4 讨论

心肌细胞凋亡是DCM 主要病理特征之一。临床研究发现在DCM 发病过程中，心肌细胞凋亡和心功能不全相互促进，最终发展为心力衰竭。心肌细胞异常凋亡数量增加，可导致心肌有效收缩单元不断减少，从而影响心脏功能。而心功能不全造成心脏射血功能降低，导致心肌缺血缺氧，进一步加剧心脏神经⁃内分泌功能失调，促进心肌细胞凋亡的发生［10］。因此，抑制心肌细胞凋亡是延缓DCM 的重要手段之一。本实验中，课题组在糖尿病大鼠模型上构建了血糖波动模型，并观察到模型组大鼠心肌细胞凋亡增加，同时血清CK⁃MB 水平升高，这与文献报道一致［11⁃13］。丹酚酸B 给药组大鼠心肌凋亡数量及血清CK⁃MB 水平均降低，提示丹酚酸B 对波动高糖诱导的糖尿病大鼠心肌细胞凋亡有改善作用。

DCM 心肌细胞凋亡发生机制较为复杂，高血糖、高血脂、氧化应激损伤以及炎症反应都是引起心肌细胞凋亡的重要原因。在众多参与凋亡调控的基因中，Bcl⁃2 家族是一种重要的调控因子［14］。Bcl⁃2 和Bax 在凋亡过程中发挥的功能是对立的，Bcl⁃2 作为抗凋亡因子，其同源二聚体有助于维持线粒体的稳态，而Bax 则发挥着促凋亡的作用。当细胞受到外界刺激时，Bcl⁃2 与Bax 的比值降低，Bcl⁃2 对Bax 的抑制作用减弱，Bax 通过寡聚化插入到线粒体外膜，造成线粒体膜通透性增加［15］，从而促发凋亡。caspase 是一种促使细胞凋亡的酶，在细胞凋亡中发挥重要作用。caspase 级联反应能被包括Bcl 家族在内的多种凋亡信号调控。caspase⁃3 是细胞凋亡过程中的终末剪切酶，是细胞凋亡的有力执行者，可通过催化细胞基质裂解，加速细胞凋亡。本实验观察到波动高血糖诱导大鼠心肌细胞凋亡增加的同时，Bcl⁃2 蛋白表达减少，Bax 与caspase⁃3 表达增加，而丹酚酸B 给药能够上调Bcl⁃2 的表达，抑制Bax 与caspase⁃3 表达，减少心肌细胞凋亡。上述结果提示丹酚酸B 对心肌的保护作用可能与增加Bcl⁃2 的表达、抑制Bax 与caspase⁃3 表达有关。

综上所述，丹酚酸B 可能通过调节Bcl⁃2 与Bax 表达抑制波动高糖诱导的大鼠心肌细胞凋亡。