益气养阴解毒方及黄芪甲苷体外对CTLA⁃4 介导的肺癌免疫逃逸的影响

姜 怡 蔡雨晴 张 朋沈丽萍刘苓霜*刘嘉湘

（1.上海中医药大学附属龙华医院，上海200032； 2.上海中医药大学研究生院，上海200120）

在我国，肺癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位［1］，严重危害人类健康。忽视机体免疫系统在肺癌发生发展中的重要作用是阻碍临床疗效提高的重要原因之一。细胞毒T 淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte⁃associated antigen⁃4，CTLA⁃4）是介导肿瘤免疫逃逸的重要抑制性分子，主要表达在活化的CD4＋和CD8＋T细胞表面，组成性地表达于调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）表面，与CD28 竞争性地结合抗原提呈细胞表面的B7分子发挥免疫抑制作用，且CTLA⁃4 与B7分子的亲和力高于CD28［2⁃3］。可溶性CTLA⁃4（soluble CTLA⁃4，sCTLA⁃4）存在于外周循环中，与淋巴细胞表面的膜型CTLA⁃4（membrane⁃bound CTLA⁃4，mCTLA⁃4）具有相同的生物学效应。

国医大师刘嘉湘教授创立的“扶正治癌”学术思想指导肺癌治疗取得了显著的临床疗效，其作用机制与免疫调节密切相关［4］。益气养阴解毒方是“扶正法”治疗肺癌的代表方，全方益气养阴以扶正固表，清热解毒标本兼顾。作者课题组前期研究发现，益气养阴解毒方及其类方可以提高肺癌患者生活质量、稳定瘤灶和延长生存期，作用机制与改善外周细胞免疫功能、下调sCTLA⁃4 表达相关［5⁃7］。黄芪是益气养阴解毒方的君药，补益肺脾之气。黄芪甲苷是黄芪最主要的单体活性成分［8］，具有抗肺癌的活性，其机制可能与抑制吲哚胺⁃2，3⁃双加氧酶（Indoleamine 2，3⁃dioxygenase，IDO）表达，进而下调Treg细胞水平，增强细胞毒性T 淋巴细胞的活性有关［9］。益气养阴解毒方及黄芪甲苷体现了中医“扶正法”提高自身抗癌能力的治疗理念。基于此，本研究并非观察中医药对肿瘤细胞的直接抑制作用，而是应用淋巴细胞与肿瘤细胞共培养体系，探讨益气养阴解毒方及黄芪甲苷通过下调mCTLA⁃4 及sCTLA⁃4表达，逆转CTLA⁃4 介导的肺癌免疫逃逸，进而抑制肿瘤的生长，并探索中医药联合CTLA⁃4 阻断剂的应用价值。

1 材料

1.1 动物和细胞 C57BL／6 小鼠，6～8 周龄，雄性，体质量约20 g，购自上海西普尔⁃必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2018⁃0006。小鼠Lewis 肺癌细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.2 药物与试剂 益气养阴解毒方由生黄芪30 g、北沙参30 g、天冬15 g、麦冬15 g、女贞子12 g、山茱萸9 g、绞股蓝15 g、仙灵脾15 g、葫芦巴12 g、石上柏30 g、石见穿30 g、重楼15 g组成，生药由上海中医药大学附属龙华医院中药房提供。益气养阴解毒方按传统方法制成水煎剂，旋转蒸发仪浓缩后制成冻干粉，冻干粉由上海中医药大学附属龙华医院科技中心实验室制备，使用真空干燥（60 ℃）。益气养阴解毒方冻干粉采用PBS 溶解，制备成质量浓度为50 mg／mL 的贮备液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤后分装，4 ℃保存备用。黄芪甲苷（北京索莱宝科技有限公司，SA8640）粉末，纯度≥98%（HPLC），用DMSO制备成质量浓度为20 mg／mL 的母液，－20 ℃保存备用。抗小鼠CTLA⁃4 单抗［clone 9H10］ （美国BioXCell 公司，660518J1），质量浓度为7.32 mg／mL，以PBS 作为溶剂，4 ℃避光保存备用。小鼠脾脏淋巴细胞分离液试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，P8860）。APC 标记的抗小鼠CD152（CTLA⁃4）单克隆抗 体（美 国Biolegend 公 司，106310）。FITC 标记的抗小鼠CD8a 抗体（美国Biolegend公司，100705）。小鼠CTLA⁃4 ELISA 试剂盒（英国Abcam公司，ab255720）。细胞计数试剂盒⁃8（CCK⁃8）（上海碧云天生物技术有限公司，C0037）。

1.3 仪器 CO2培养箱（美国赛默飞世尔科技公司，51020241）；倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司，OLYMPAS IX71）；台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，L500）；多功能酶标仪（美国MD 公司，SpectraMax M2e）；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司，FACS Calibur）。

2 方法

2.1 细胞培养 取培养基RPMI 1640，加10% FBS 和1%双抗（100 U／mL 青霉素及100 U／mL 链霉素），将消化后的Lewis 肺癌细胞与配置好的培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期的Lewis 肺癌细胞用于后续实验。

2.2 小鼠脾脏淋巴细胞分离 无菌条件下摘取C57BL／6小鼠脾脏，撕去脾脏被膜，用眼科剪将脾脏剪成小块。将200 目尼龙筛网放置于平皿上，加入少量组织稀释液，将脾脏放置于筛网上，使用注射器活塞来研磨脾脏。研磨完全后使用组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。加入与脾脏单细胞悬液等量的分离液。吸取单细胞悬液加于分离液液面上。室温，2 500 r／min，离心25 min。用移液枪吸取第二层环状乳白色淋巴细胞至另一洁净的15 mL离心管中，向离心管中加入10 mL细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，1 000 r／min，离心10 min。弃上清，5 mL 的细胞清洗液重悬细胞，1 000 r／min，离心10 min，并重复一遍。弃上清，细胞重悬备用。

2.3 小鼠脾脏淋巴细胞与Lewis 肺癌细胞共培养体系及分组给药 将对数生长期Lewis 肺癌细胞和小鼠脾脏淋巴细胞进行细胞接触式共培养，共培养时间为24 h。分为空白对照组、黄芪甲苷组（单体组）、益气养阴解毒方组（复方组）、抗CTLA⁃4 单抗组（单抗组）、黄芪甲苷＋抗CTLA⁃4 单抗组（单体＋单抗组）、益气养阴解毒方＋抗CTLA⁃4 单抗组（复方＋单抗组）。本研究预实验采用CCK⁃8 法检测益气养阴解毒方和黄芪甲苷对Lewis 肺癌细胞存活率的影响以选择合适的给药浓度，结果显示益气养阴解毒方给药浓度1 000 μg／mL、黄芪甲苷给药浓度80 μg／mL 以下对Lewis肺癌细胞生长无影响，并参考抗CTLA⁃4 单抗促进IL⁃2 和INF⁃γ分泌、增强免疫功能的体外研究［10］，本实验益气养阴解毒方、黄芪甲苷及抗CTLA⁃4 单抗的给药浓度分别为500、50、5 μg／mL。

2.4 流式细胞术检测mCTLA⁃4 及CD8＋T细胞的表达 将对数生长期的Lewis 肺癌细胞（1×106／mL）接种于6 孔板中，每孔1 mL，每组3 复孔，待肿瘤细胞贴壁后，加入小鼠脾脏淋巴细胞（1×106／mL），每孔1 mL，根据组别加入益气养阴解毒方（500 μg／mL）、黄芪甲苷（50 μg／mL）、抗CTLA⁃4 单抗（5 μg／mL），共培养24 h。从共培养体系中吸取悬浮的淋巴细胞，PBS 清洗2 次后，加入CD8、CTLA⁃4 抗体，避光孵育30 min。PBS 清洗，加入300 μL PBS 重悬细胞，流式细胞仪上机检测CD8＋T细胞和mCTLA⁃4。

2.5 ELISA 检测sCTLA⁃4 共培养体系同“2.4”，取共培养所得上清，严格按照小鼠CTLA⁃4 ELISA 试剂盒说明书进行操作。根据试剂盒中提供的标准品浓度绘制标准曲线，计算其质量浓度，单位用pg／mL 表示。

2.6 CCK⁃8 检测Lewis 肺癌细胞的增殖情况 在96 孔板里，每孔加入Lewis 肺癌细胞（2 000个细胞）在含10%FBS 的RPMI 1640 培养液中进行培养，待肿瘤细胞贴壁后，加入小鼠脾脏淋巴细胞（2 000个细胞），根据组别加入益气养阴解毒方（500 μg／mL）、黄芪甲苷（50 μg／mL）、抗CTLA⁃4 单抗（5 μg／mL），每孔终体积为100 μL，每组3个复孔，共培养24 h，弃去培养上清（包括淋巴细胞），PBS 清洗1 次后每孔加入10 μL CCK⁃8 溶液和90 μL 含10% FBS 的RPMI 1640 培养液，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱内继续孵育4 h，在450 nm 测定吸光度值。计算细胞存活率，存活率＝（OD实验组／OD对照组）×100%。

2.7 统计学分析 采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，实验数据以（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。运用GraphPad Prism 5 软件进行作图。

3 结果

3.1 益气养阴解毒方及黄芪甲苷对mCTLA⁃4 及CD8＋T细胞的影响 与空白对照组比较，单体组、复方组、单抗组、单体＋单抗组和复方＋单抗组mCTLA⁃4 表达降低（P＜0.01）；与单体组比较，单抗组、单体＋单抗组和复方＋单抗组mCTLA⁃4 表达降低（P＜0.01）；与复方组比较，单体＋单抗组和复方＋单抗组mCTLA⁃4 表达降低（P＜0.05）；与单抗组比较，复方＋单抗组mCTLA⁃4 表达降低（P＜0.01）。与空白对照组比较，单体组、复方组、单抗组、单体＋单抗组和复方＋单抗组CD8＋T细胞表达升高（P＜0.05）；与单体组比较，单抗组、单体＋单抗组和复方＋单抗组CD8＋T细胞表达升高（P＜0.01）；与复方组比较，复方＋单抗组CD8＋T细胞比例升高（P＜0.01）。见图1。

图1 益气养阴解毒方及黄芪甲苷对mCTLA⁃4 和CD8＋T细胞表达的影响（n＝3）

3.2 益气养阴解毒方及黄芪甲苷对sCTLA⁃4 的影响 与空白对照组比较，单体组、复方组、单抗组、单体＋单抗组和复方＋单抗组sCTLA⁃4 表达降低（P＜0.01）；与单体组比较，复方组、单抗组、单体＋单抗组和复方＋单抗组sCTLA⁃4 表达降低（P＜0.01）；与复方组比较，单抗组、单体＋单抗组和复方＋单抗组sCTLA⁃4 表达降低（P＜0.01）；与单抗组比较，复方＋单抗组sCTLA⁃4 表达降低（P＜0.05）。见图2。

图2 益气养阴解毒方及黄芪甲苷对sCTLA⁃4 的影响（n＝3）

3.3 益气养阴解毒方及黄芪甲苷对共培养体系中Lewis 肺癌细胞增殖的影响 与空白对照组比较，单体组、复方组、单抗组、单体＋单抗组和复方＋单抗组Lewis 肺癌细胞存活率降低（P＜0.01）；与单体组比较，复方组、单体＋单抗组和复方＋单抗组Lewis 肺癌细胞存活率降低（P＜0.01）；与复方组比较，单体＋单抗组和复方＋单抗组Lewis 肺癌细胞存活率降低（P＜0.05）；与单抗组比较，单体＋单抗组和复方＋单抗组Lewis 肺癌细胞存活率降低（P＜0.01）；与单体＋单抗组比较，复方＋单抗组Lewis 肺癌细胞存活率降低（P＜0.05）。见图3。

图3 益气养阴解毒方及黄芪甲苷对Lewis 肺癌细胞增殖的影响（n＝3）

4 讨论

免疫应答过程中T细胞的激活需要双信号作用。第一信号主要来自T细胞抗原识别受体与抗原肽⁃主要组织相容性复合体的特异性结合；第二信号由一系列共刺激分子提供，免疫检查点就是其中负性共刺激分子，主要包括CTLA⁃4、程序性死亡分子1（programmed death 1，PD⁃1）及程序性死亡分子1 配体（PD⁃1 ligand，PD⁃L1）等，其作用类似于T细胞的“制动系统”，抑制特异性T细胞的活化、增殖，限制免疫系统对自身健康细胞进行攻击。然而，恶性肿瘤利用免疫检查点这一特性逃避机体免疫杀伤。CTLA⁃4 主要在外周淋巴器官中抑制T细胞的活化［11］，在肿瘤微环境中亦可发挥免疫抑制作用［12］。sCTLA⁃4 是由于CTLA⁃4 选择性剪切使CTLA⁃4 基因缺失第三外显子而形成，亦与B7分子结合，阻断CD28／B7 通路，抑制机体免疫功能［13］。

中医学认为“正气亏虚”是肺癌发生、发展的根本，邪毒则是肺癌发生的重要条件。早在20 世纪70年代，刘嘉湘教授在全国率先系统地提出“扶正治癌”学术思想和治疗方法，通过提高机体自身抗癌能力达到“人瘤共存”“带瘤生存”的目的，其机制可以从调节机体免疫功能方面深入研究。益气养阴解毒方是“扶正法”治疗肺癌的代表方，由生黄芪、北沙参、天冬、麦冬、女贞子、山茱萸、绞股蓝、仙灵脾、葫芦巴、石上柏、石见穿、重楼组成。生黄芪补益肺脾之气，北沙参滋养肺胃之阴液、润肺止咳，共为君药；天冬、麦冬、女贞子、山茱萸、绞股蓝为臣药，增强益气养阴的功效；仙灵脾、葫芦巴、石上柏、石见穿、重楼为佐药，仙灵脾、葫芦巴具有温肾阳，暖脾阳之功，其与黄芪合用，益气作用更强，其与滋养阴液诸药同用，则刚柔相济，石上柏、石见穿、重楼清热解毒，祛邪以扶正；天冬在本方中又取其入肺经亦作为使药之用。全方具有益气养阴、清热解毒之功效。研究显示，益气养阴解毒方及其类方具有稳定瘤灶、延长生存期的作用，机制与改善机体外周细胞免疫功能相关［5⁃6］。黄芪甲苷是黄芪最主要的单体活性成分，具有调节免疫系统、下调免疫抑制因子IDO 表达以及增强对抗癌药物敏感性等作用［8⁃9，14］。本课题组前期研究显示，晚期非小细胞肺癌（non⁃small⁃cell lung cancer，NSCLC）患者外周血中sCTLA⁃4 高表达［15］；益气养阴解毒方及其类方的作用机制可能为下调晚期NSCLC 患者外周血中sCTLA⁃4 的表达［7］。由此，推测调控CTLA⁃4 介导的肺癌外周及微环境的免疫耐受可能是益气养阴解毒方的重要作用机制之一，值得进一步深入研究。

基于中医“扶正法”提高自身抗癌能力的治疗理念，本实验并非观察中药复方及单体直接抑制肿瘤细胞增殖的作用，而是运用淋巴细胞与肿瘤细胞共培养的方法，探讨益气养阴解毒方及黄芪甲苷是否通过下调CTLA⁃4 表达，进而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，并观察中医药与免疫检查点抑制剂的协同增效作用。研究发现，黄芪甲苷、益气养阴解毒方、抗CTLA⁃4 单抗均能下调共培养体系中mCTLA⁃4 和sCTLA⁃4 的表达，提高CD8＋T细胞水平，黄芪甲苷或益气养阴解毒方联合抗CTLA⁃4 单抗具有协同增效的作用。研究证实，益气养阴解毒方及黄芪甲苷可以通过下调免疫抑制分子mCTLA⁃4 和sCTLA⁃4，逆转CTLA⁃4 介导的肺癌免疫逃逸，从而发挥抗癌作用，体现了中医“扶正治癌”提高自身抗癌能力的作用内涵。研究中，给药组均提高了CD8＋T细胞的表达，可能与CD8＋T细胞中细胞毒杀伤性亚群的增殖有关，课题组后续研究将进一步对T细胞表型进行分析，并深入挖掘中医药如何调控CTLA⁃4 表达的分子机制，以期为完善中医“扶正治癌”的作用机制提供研究基础。