雪峰虫草不同提取部位对诱导NB4 和U937细胞凋亡的影响

蔡 媛杜 青谢芳一张水寒

（湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙410006）

急性淋巴细胞性白血病（Acute lymphocytic leukemia，ALL）是一种进行性造血系统恶性肿瘤，约占肿瘤发病率5%，且多发于儿童［1］。目前，对急性白血病的治疗主要是化疗、骨髓移植、靶向治疗及细胞免疫治疗、CAR⁃T 治疗等，但其有损伤机体正气、排异反应、细胞因子风暴等不良反应［2］。因此，临床迫切需求能够扶正祛邪、杀伤肿瘤细胞的药物。临床实践证明中医药治疗肿瘤有其独特优势，具有疗效好、多靶点、低毒性等特点，从中药中寻找高效、低毒、不产生耐药性的抗肿瘤药物是一个切实可行的途径［3］。虫草类资源因其含核苷、多肽、萜类、多糖、甾醇等化合物，具有不同程度抗肿瘤活性，一直是肿瘤药物研发的热点［4］，但因其稀缺，价格昂贵，在临床上使用受限。雪峰虫草是线虫草菌科真菌雪峰虫草菌（Ophiocordyceps xuefengensis）寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，与冬虫夏草亲缘关系极近［5］，是一种新的虫草资源，具有显著的防癌治癌的效果。课题组前期发现雪峰虫草，对NB4 和U937细胞的IC50为3.76 和1.91μg／mL，根据《国家新药（西药）临床前研究指导原则汇编》 规定可判定其在体外对细胞具有杀伤作用［6］，初步认定雪峰虫草具有较强的体外抗肿瘤活性，但其主要药效物质基础及具体的机制尚未明确。为了探究雪峰虫草物质组成，明确其高效抗肿瘤活性物质的分布，本实验以早幼粒白血病细胞NB4 和U937 为研究对象，采用不同极性溶剂对雪峰虫草进行萃取后给药干预，初探其主要药效成分群，并分析其抗肿瘤可能的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株 早幼粒白血病细胞株（NB4 和U937），购于中国科学院上海细胞库。

1.2 药物与试剂 雪峰虫草采于湖南省洞口县雪峰山脉，经湖南省中医药研究院中药研究所生药室刘浩副主任鉴定为雪峰虫草Ophiocordyceps xuefengensis。胎牛血清FBS（美国Gibco 公司，批号42A0071K）；DMEM 高糖培养基（美国Gibco 公司，批号8117165）；兔抗小鼠Cyt C 抗体（bs⁃4563R）、兔抗小鼠Bcl⁃2 抗体（10993⁃1⁃AP）、兔抗小鼠Bax 抗体（50599⁃2⁃lg）、兔抗小鼠caspase⁃9 抗体（10380⁃1⁃AP）均为美国proteintech 公司；FITC AnnexinⅤApoptosis Detection Kit 购自美国BD 公司。

1.3 仪器 IX71型荧光倒置显微镜（日本Olympus 公司）；超低温冰箱（青岛海尔电器国际股份有限公司）；三气培养箱（德国Eppendorf 公司）；高压蒸汽灭菌锅（美国Zealway 公司）；流式细胞仪（美国BD 公司）；电泳仪、蛋白印迹成像和定量分析系统（美国Bio⁃Rad 公司）。

2 方法

2.1 药物制备 将雪峰虫草烘干研末，称定后置于2 000 mL圆底烧瓶，加入8 倍量蒸馏水回流提取2 次，每次2 h，滤过，收集滤液并冷冻干燥得到水提取物，1 g 提取物相当于生药122 g。残渣加入6 倍量75%乙醇回流提取2 次，每次2 h，滤过，收集滤液冷冻干燥得到醇提取物，1 g 提取物相当于生药126 g。取醇提取冷冻干燥粉用1.5倍体积乙酸乙酯连续萃取至乙酸乙酯层近无色，合并萃取液，冷冻干燥至粉末获得乙酸乙酯提取物，1 g 提取物相当于生药138 g。精密称定5 mg 不同提取物溶于25 μL DMSO，再定容至0.5 mL，超声15 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，得到终质量浓度10 倍的提取物母液（10 mg／mL），后续稀释至所需质量浓度进行给药干预。

2.2 细胞培养 将NB4、U937细胞培养于含有DMEM 高糖培养基、10% FBS、1%双抗和1%L⁃谷氨酰胺制成的培养液中，放置于37 ℃、5% CO2的培养箱，取对数期细胞进行实验。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 取对数生长期的NB4、U937细胞，离心，弃上清，用Binding Buuffer 重悬细胞，按照FITC Annexin Ⅴ／PI 凋亡试剂盒说明书操作，加入荧光染料PI 和FITC Annexin Ⅴ孵育后，流式细胞仪上机检测。此实验重复3 次。左下象限Q4 区代表活细胞（Annexin Ⅴ－／PI－），左上象限 Q1 区代表死亡细胞（Annexin Ⅴ－／PI＋），右下象限Q3 区代表早期凋亡细胞（Annexin Ⅴ＋／PI－），右上象限Q2 区代表晚期凋亡细胞（Annexin Ⅴ＋／PI＋）。

2.4 Western blot 法检测NB4、U937细胞内凋亡蛋白表达取对数生长期的NB4、U937细胞，并接种至96 孔板中，将两种细胞均随机分为正常组、DMSO组、水提取物组、乙酸乙酯提取物组和醇提取物组，合计10组。细胞静置培养24 h 后，收集细胞悬液，1 200 r／min 离心5 min，重悬细胞，然后按分组详情分别加入0.5% DMSO、1 mg／mL 水提取物、1 mg／mL 乙酸乙酯提取物、1 mg／mL 醇提取物，正常组则给予等量培养液。所有组细胞继续培养干预作用24 h 后，收集细胞悬液，1 500 r／min 离心10 min，去上清，加入蛋白酶抑制剂PMSF 和RIPA细胞裂解液（1∶100）的蛋白质抽提试剂，于冰上裂解2 h，12 000 r／min 离心10 min，取上清、分装，－80 ℃保存、备用。采用BCA 试剂盒分别测定蛋白浓度，并根据各蛋白分子量大小选择合适的电泳分离胶和浓缩胶。待蛋白样本与上样缓冲液混匀、变性后，进行上样处理，经电泳、转模、封闭后，加入一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，加入HRP 标记的二抗缓冲液，室温振摇孵育1 h，最后采用ECL 化学发光检测，并通过蛋白印迹成像和定量分析系统进行扫描，并计算各蛋白的相对光密度值。

2.5 统计学处理 采用SPSS Statistics 17.0 软件进行分析，实验数据以（）表示。数据满足正态性且组间方差齐，则采用单因素方差分析；以Bonferroni 法进行两组间的比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 雪峰虫草不同提取物对NB4、U937细胞凋亡的影响与正常组比较，DMSO组细胞凋亡率无明显变化，说明DMSO 溶剂对细胞的凋亡无影响，其余提取物组NB4、U937细胞凋亡率均增加（P＜0.05，P＜0.01）；相较水提取物组和醇提取物组，乙酸乙酯提取物组诱导细胞凋亡作用更为明显。见图1～2。

图1 雪峰虫草不同提取物对NB4细胞凋亡率的影响（n＝3）

3.2 雪峰虫草不同提取物对NB4、U937细胞凋亡蛋白表达的影响 正常组与DMSO组无明显差异，与正常组比较，水提取物组、乙酸乙酯提取物组和醇提取物组NB4、U937细胞内Cyt C、Bax 和caspase⁃9 蛋白表达增加，Bcl⁃2 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）；相较水提取物组，乙酸乙酯提取物组NB4、U937细胞内Cyt C、Bax 和caspase⁃9 蛋白表达增加，Bcl⁃2 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表1～2、图3～4。

图3 雪峰虫草不同提取物对NB4细胞凋亡蛋白的影响

表1 雪峰虫草不同提取物对NB4细胞凋亡蛋白表达的影响（， n＝3）

表1 雪峰虫草不同提取物对NB4细胞凋亡蛋白表达的影响（， n＝3）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与水提取物组比较，＃P＜0.05；与醇提取物组比较，△P＜0.05。

表2 雪峰虫草不同提取物对U937细胞凋亡蛋白的影响（， n＝3）

表2 雪峰虫草不同提取物对U937细胞凋亡蛋白的影响（， n＝3）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与水提取物组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

图2 雪峰虫草不同提取物对U937细胞凋亡率的影响（n＝3）

图4 雪峰虫草不同提取物对U937细胞凋亡蛋白的影响

4 讨论

我国虫草类药用资源一直是抗肿瘤药物研发热点，虫草中含有核苷、多肽、生物碱、萜类、多糖、甾醇等化合物，具有良好的抗肿瘤活性［7⁃8］。有研究表明，冬虫夏草对肺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤等，都显示出不同程度的抑制作用，可与抗癌药物联用，共同发挥肿瘤抑制作用。但因虫草资源稀缺，市场价格昂贵，在临床上尚未得到广泛应用。雪峰虫草作为第四次全国中药资源普查发现的一种虫草新资源，具有生态适应幅度广，资源量大等优势，与冬虫夏草的亲缘关系最近。经主要功效成份与药效学对比研究，具有相同的腺苷、虫草素、虫草酸、氨基酸等化学成分及类似的功效，在洞口县瑶族民间作为冬虫夏草代用品有近百年应用历史，效果显著，是冬虫夏草最有前景的代用品。

目前，抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡的最主要机制是影响信号传导途径，即死亡受体途径和线粒体途径［9］。大量基因或相关蛋白以直接或间接的方式参与了凋亡信号的传导与调控。在细胞凋亡的内源途径中，线粒体处于中心地位［10］，当线粒体产生能量代谢障碍，线粒体膜完整性发生改变，能促使线粒体细胞色素C（Cyt C）释放入胞质中，与凋亡因子Apaf⁃1 结合并通过caspases 募集结构域招募caspase⁃9 形成Cyt⁃C⁃Apaf⁃1⁃caspase⁃9 前体“凋亡体”，激发caspase 级联反应，进而导致细胞凋亡［11⁃12］。另外，凋亡因子Cyt C 的释放源于线粒体外膜通透性的改变，其主要受到Bcl⁃2 蛋白家族的调控，其主要包括Bcl⁃2 亚家族蛋白中的抑凋亡蛋白Bcl⁃2 和Bax 亚家族的促凋亡蛋白Bax等，在线粒体途径信号传导中起着重要作用［13］。本实验通过采用雪峰虫草不同提取物作用于U937 和NB4细胞，通过FLC 检测细胞增殖和凋亡情况，发现不同提取物对淋巴细胞具有不同程度的抑制，其中乙酸乙酯提取部位最为明显。为了验证雪峰虫草提取物是否通过调控线粒体途径通路诱导U937 和NB4细胞发生凋亡，利用Western blot 实验对通路相关蛋白Bax、caspase⁃9、Cyt C、Bcl⁃2 表达情况进行检测，发现雪峰虫草不同提取物均可以上调Bax、caspase⁃9、Cyt C 蛋白的表达，下调Bcl⁃2 蛋白的表达，且乙酸乙酯部位和醇提部位效果最为显著。本实验对雪峰虫草的三个主要有效提取部位促进体外U937 和NB4细胞凋亡和机制进行了探讨，综上表明，雪峰虫草乙酸乙酯提取部位诱导U937 和NB4细胞发生线粒体依赖性凋亡效果最为明显，可能与调节凋亡相关蛋白，特别是Bax 的表达有关。

初步探讨了雪峰虫草不同提取物对急性早幼粒细胞性白血病细胞NB4 和U937 的促凋亡作用，并证明其诱导NB4 和U937细胞发生线粒体依赖性凋亡，初步阐明了雪峰虫草对急性淋巴白血病体外作用机理，为急性淋巴白血病的治疗与新药开发提供了科学依据。下一步研究重点将对乙酸乙酯部位进行药效成分定性定量分析及药效评价，为深入研究雪峰虫草药效物质基础及建立其谱效关联方法提供思路。