黄芩苷通过调节miR⁃223⁃3p／NLRP3 通路对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用

李长力郑喜胜贾明雅

（河南省南阳市中心医院重症医学科，河南 南阳473000）

脓毒症是导致危重病房患者死亡的常见原因之一，多发于休克、严重烧伤、创伤、感染和大手术后，可引发全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）［1］。肺部是因SIRS 最早受累的器官，急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是脓毒症患者常见的并发症之一［2］。ALI 与炎症相关，其进程伴随促炎因子大量释放，抗炎因子／促炎因子水平失衡是促进ALI 发展的关键因素［3⁃4］。黄芩苷是一种从唇形科植物黄芩根中提取而来的黄酮类成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化等药理作用［5⁃6］。NOD 样受体蛋白3（NOD⁃like receptor protein 3，NLRP3）参与炎症反应，并在ALI 大鼠肺组织高表达［7］。微小RNA（microRNA，miRNA）可与靶基因3′⁃UTR 配对结合，参与机体生理进程，miR⁃223⁃3p 过表达可抑制促炎症因子表达［8］。本研究通过构建脓毒症ALI大鼠模型，使用不同剂量黄芩苷处理后，测定相关指标，旨在从miR⁃223⁃3p／NLRP3 通路揭示黄芩苷对脓毒症ALI 大鼠的保护作用，为黄芩苷在临床上治疗ALI 提供理论依据。

1 材料

黄芩苷（货号B20570⁃100 mg，纯度≥98%）、地塞米松（货号B25793⁃100 mg，纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；白细胞介素1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β，货号E⁃EL⁃R0012c）、白细胞介素 10（interleukin⁃10，IL⁃10，货号E⁃EL⁃R0016c）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α，货号E⁃EL⁃R0019c）ELISA 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠NLRP3 一抗（货号orb319065）购自武汉博欧特生物科技有限公司；兔抗鼠内参β⁃Actin（货号AP0060）、羊抗兔IgG／HRP 二抗（货号BD5003）均购自厦门研科生物技术有限公司；ZF⁃388 全自动凝胶成像分析系统购自深圳市三利化学品有限公司；XSP⁃9CA型生物显微镜购自上海光学仪器厂。SPF 级雄性Wistar 大鼠购自广州中医药大学实验动物中心，体质量220～250 g，7 周龄，动物使用许可证号SYXK（粤）2018⁃0001。

2 方法

2.1 造模、分组与给药 适应性饲养1 周后根据文献采用盲肠结扎穿孔法（CLP）建立脓毒症ALI大鼠模型［9］。大鼠术前不需禁食，以1.25 g／kg 剂量乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位固定，备皮，75%乙醇消毒，用手术剪沿腹正中线剪开约2 cm长的切口，分离肠系膜，暴露盲肠，用丝线结扎回盲肠瓣下方盲肠根部位置，用18号针头穿透结扎端盲肠，挤出粪便及肠内容物于腹腔内，随后将肠管收回腹腔，缝合，消毒。大鼠造模后6 h 出现竖毛、呼吸困难、腹泻、躁动、爪趾青紫、萎靡等症状，说明造模成功。实验分为假手术组（手术开腹后，仅暴露盲肠，随后缝合）、模型组、地塞米松组（0.27 mg／kg）［10］、低剂量黄芩苷组（10 mg／kg）、中剂量黄芩苷组（50 mg／kg）、高剂量黄芩苷组（100 mg／kg）［11］，每组18 只。造模6 h后，腹腔注射给药（给药量2 mL／kg），假手术组和模型组注射等量生理盐水。

2.2 ELISA 测定大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃10水平 给药24 h 后，鼠尾抽血，离心后分离血清，置于－20 ℃冰箱中保存。从－20 ℃冰箱中取出各组大鼠血清，采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定各组大鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃10 水平，测定步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.3 大鼠肺组织病理学观察 各组任意选取6 只大鼠立刻脱颈处死，左肺组织用4% 多聚甲醛固定，将固定后的左肺组织用石蜡常规包埋，制成厚度4～6 μm 切片，行HE 染色，封片后在光学显微镜下参考王宝家等［12］改良版肺组织病理评分标准（见表1），观察各组大鼠肺组织病理改变情况并进行肺组织病理评分。

表1 肺组织病理评分标准Tab.1 Criteria for scoring of pulmonary pathology

2.4 大鼠肺组织含水量测定 取右肺组织用于测定肺组织含水量，用天平称量左肺组织湿质量（wet weight，WW），然后放入60 ℃烘箱烘干，称定其干质量（dry weight，DW），计算WW／DW比值以表示肺组织含水量。WW／DW比值＝（WWDW）／DW。

2.5 大鼠AFC值测定 各组任意选取6 只大鼠脱颈处死，分离出全部气管、肺脏及心脏用于测定肺泡液体清除率（alveolar fluid clearance，AFC）。将气管导管插入右下肺，以4 mL／kg 剂量将5%白蛋白（0.15 mg 伊文思蓝标记）等渗生理盐水灌注液经气管导管滴入右肺下叶，随后给予2 mL 氧气，以确保灌注液顺利到达肺部。保持全氧，维持气道压在650～700 Pa 之间，持续通气1 h。最后取0.2 mL右下肺液体，测定620 nm 处吸光度值并根据公式计算AFC。AFC% ＝（灌入肺泡内液体量－肺泡内剩余液体量）；泡内剩余液体量＝灌入肺泡内液体量×最初蛋白浓度／最终蛋白浓度。

2.6 RT⁃qPCR 测定大鼠肺组织miR⁃223⁃3p表达剩余6 只大鼠脱颈处死，分离左肺组织，用于测定miR⁃223⁃3p表达。取左肺组织，加入匀浆液，充分匀浆，离心后取上清，用RNA 提取试剂盒提取总RNA，行逆转录得cDNA，反应体系为5×AMV buffer 2.0 μL，RNA（1.0 μg／μL）1.0 μL，DEPC water 2.0 μL，reverse primer（50 pmol／μL）0.5 μL，2.5 mmol／L each dNTP mixture 4.0 μL，AMV enzyme 0.5 μL。行RT⁃qPCR 反应，体系共20 μL为正反向引物各0.5 μL，去离子水4.0 μL，cDNA

5.0 μL，2 × SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL。反应程序为95 ℃5 min，95 ℃15 s、60 ℃34 s，40个循环，75 ℃5 min。miR⁃223⁃3p正向引物序列5′⁃GGGGTGTCAGTTTGTCAAA⁃3′，反向引物序列5′⁃CAGTGCGTGTCGTGGAGT⁃3′；内参U6 正向引物序列5′⁃ATTGGAACGATACAGAGAAGATT⁃3′，反向引物序列5′⁃GGAACGCTTCACGAATTTG⁃3′。采 用2－ΔΔCT法对miR⁃223⁃3p 表达行定量分析。

2.7 蛋白印迹法测定大鼠肺组织NLRP3 表达 取右肺组织测定NLRP3 表达，加入蛋白裂解液充分裂解，离心后取上清，提取总蛋白并测定浓度。电泳分离目标蛋白，转到PVDF 膜上，用5%BSA 封闭，分别加入相应兔抗鼠NLRP3、β⁃actin 一抗（1∶1 000）孵育24 h，加入羊抗兔IgG／HRP 二抗孵育2 h，显色，测定条带灰度值，蛋白相对表达＝目标蛋白灰度值／内参蛋白灰度值。

2.8 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（）表示，多组比较采用单因素方差分析，2组间比较采用SNK⁃q 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠血清IL⁃1β、IL⁃10、TNF⁃α 水平 与假手术组比较，模型组大鼠血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平升高（P＜0.05），IL⁃10 水平降低（P＜0.05）；经黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，IL⁃1β、TNF⁃α 水平依次降低（P＜0.05），IL⁃10 水平依次升高（P＜0.05）；高剂量黄芩苷组IL⁃1β、IL⁃10、TNF⁃α水平与地塞米松组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清IL⁃1β、IL⁃10、TNF⁃α 水平比较（， n＝18）Tab.2 Comparison of serum levels of IL⁃1 β， IL⁃10 and TNF ⁃α in rats of each group（， n＝18）

表2 各组大鼠血清IL⁃1β、IL⁃10、TNF⁃α 水平比较（， n＝18）Tab.2 Comparison of serum levels of IL⁃1 β， IL⁃10 and TNF ⁃α in rats of each group（， n＝18）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与低剂量黄芩苷组比较，▲▲P＜0.01；与中剂量黄芩苷组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.2 大鼠肺组织病理学变化 与假手术组比较，模型组大鼠肺泡完整性破坏，可见大部分肺泡萎陷，肺间质增厚，可见明显水肿，并伴有大量炎症细胞浸润，肺组织病理得分升高（P＜0.01）。经黄芩苷治疗后，大鼠肺泡结构有所恢复，肺间质水肿缓解，炎症细胞浸润减少，且呈剂量依赖性，肺组织病理得分随剂量升高依次降低（P＜0.01）。高剂量黄芩苷组大鼠肺组织病理改变情况与地塞米松组相当，肺组织病理得分与地塞米松组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表3。

图1 各组大鼠肺组织HE 染色（×100）Fig.1 Pulmonary morphology of rats in each group by HE staining（×100）

表3 各组大鼠肺组织病理评分比较（， n＝6）Tab.3 Comparison of pulmonary pathological scores of rats in each group（， n＝6）

表3 各组大鼠肺组织病理评分比较（， n＝6）Tab.3 Comparison of pulmonary pathological scores of rats in each group（， n＝6）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01；与低剂量黄芩苷组比较，▲▲P ＜0.01；与中剂量黄芩苷组比较，△△P＜0.01。

3.3 大鼠肺组织含水量 与假手术组比较，模型组大鼠WW／DW比值升高（P＜0.01）；经黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，WW／DW比值依次降低（P＜0.01）；高剂量黄芩苷组WW／DW比值与地塞米松组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠肺组织WW／DW 比值比较（， n＝6）Tab.4 Comparison of pulmonary WW／DW ratio of rats in each group（， n＝6）

表4 各组大鼠肺组织WW／DW 比值比较（， n＝6）Tab.4 Comparison of pulmonary WW／DW ratio of rats in each group（， n＝6）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01；与低剂量黄芩苷组比较，▲▲P ＜0.01；与中剂量黄芩苷组比较，△△P＜0.01。

3.4 大鼠AFC值 与假手术组比较，模型组大鼠AFC值降低（P＜0.01）；经黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，AFC值依次升高（P＜0.01）；高剂量黄芩苷组AFC值与地塞米松组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 各组大鼠AFC值比较（%， x ±s， n＝6）Tab.5 Comparison of AFC values of rats in each group（%， x ±s， n＝6）

3.5 大鼠肺组织miR⁃223⁃3p、NLRP3 表达 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织miR⁃223⁃3p表达降低，NLRP3 表达升高（P＜0.05）；经黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，miR⁃223⁃3p表达依次升高，NLRP3 表达依次降低（P＜0.05，P＜0.01）；高剂量黄芩苷组miR⁃223⁃3p、NLRP3 表达与地塞米松组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表6。

图2 各组大鼠肺组织NLRP3 表达比较Fig.2 Comparison of pulmonary NLRP3 expressions of rats in each group

表6 各组大鼠肺组织miR⁃223⁃3p、NLRP3 表达比较（， n＝6）Tab.6 Comparison of pulmonary miR⁃223⁃3p and NLRP3 expressions of rats in each group（， n＝6）

表6 各组大鼠肺组织miR⁃223⁃3p、NLRP3 表达比较（， n＝6）Tab.6 Comparison of pulmonary miR⁃223⁃3p and NLRP3 expressions of rats in each group（， n＝6）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与低剂量黄芩苷组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与中剂量黄芩苷组比较，△△P＜0.01。

4 讨论

中医学认为ALI 属于“外感热病”，符合“温热病”的范畴［13］。近年来，中草药的药理作用受到广泛关注，黄芩苷因具有抗炎作用而有望成为治疗ALI 的候选药物，因此本研究通过构建脓毒症ALI 大鼠模型，探究黄芩苷治疗ALI 的作用机制。大鼠造模后6 h 出现竖毛、呼吸困难、腹泻、躁动、爪趾青紫、萎靡等症状，表明造模成功可用于后续实验。

炎症反应伴随ALI 进程，研究发现，黄芩苷可下调NLRP3 水平及促炎因子IL⁃1β、IL⁃6 水平，以缓解轻度抑郁症大鼠脑皮层炎症反应［14］。此外，黄芩苷对急性损伤器官具有保护作用，可显著减少马兜铃酸诱导的小鼠肾脏细胞凋亡并缓解肾脏损伤［15］。本研究发现，经黄芩苷治疗后，脓毒症ALI 大鼠肺泡结构有所恢复，肺间质水肿缓解，炎症细胞浸润减少，肺组织病理评分降低，且呈剂量依赖性。AFC 是由肺泡内的肾上腺素受体控制，是反应肺组织间质稳态的指标，亦可反映肺间质水肿情况，与肺功能联系紧密［16］。本研究发现，黄芩苷可减少脓毒症ALI 大鼠肺组织含水量，提升AFC值，提示黄芩苷可改善脓毒症ALI 大鼠症状，改善肺损伤，恢复肺功能。IL⁃1β 和TNF⁃α 是常见的促炎症因子，TNF⁃α 主要表达在中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞胞浆中，能够引起炎症细胞聚集，合成并释放IL⁃1β，参与炎症反应，IL⁃10 释放可抑制促炎症因子释放，抑制炎症反应［17⁃18］。Yang 等［18］发现IL⁃1β 和TNF⁃α 在脓毒症ALI 大鼠肺组织表达上调，可用于反映病情程度。另外，上调抑炎因子IL⁃10 水平，下调促炎因子IL⁃6 水平可抑制肺泡巨噬细胞及中性粒细胞聚集，可有效控制肺部炎症反应［19］。本研究发现，与假手术组比较，模型组大鼠血清IL⁃1β、TNF⁃α 水平升高，IL⁃10 水平降低，说明脓毒症ALI 模型大鼠发生炎症反应，可能造成炎症损伤。经黄芩苷治疗后，IL⁃1β、TNF⁃α 水平降低，IL⁃10 水平升高，提示黄芩苷可调整促炎因子／抑炎因子平衡，缓解脓毒症ALI 模型大鼠炎症反应。但是黄芩苷通过何种信号通路缓解炎症反应还需进一步探究。

NLRP3 炎症小体通路参与炎症调控进程，Luo等［20］发现血红素加氧酶⁃1 可抑制肺组织NLRP3、NF⁃κB 活性，减弱肺组织和血清IL⁃1β 和IL⁃18分泌，可用于治疗脓毒症ALI 大鼠。Yin 等［21］发现，异氟烷以活性氧依赖性方式降低NLRP3 活性，下调IL⁃1β、IL⁃18 mRNA 表达，以减轻脂多糖诱导的脓毒症ALI 大鼠肺组织病理学损伤、水肿和血管通透性。经黄芩苷治疗后，大鼠肺组织NLRP3 水平降低，提示黄芩苷可能通过抑制NLRP3 炎症小体活性，以缓解炎症损伤。miRNA 可靶向调控靶基因，而NLRP3 是miR⁃223⁃3p 的直接靶标，上调miR⁃223⁃3p 水平，可抑制NLRP3 活性［22］。本研究发现，经黄芩苷治疗后，大鼠肺组织miR⁃223⁃3p升高，提示黄芩苷可能通过上调miR⁃223⁃3p 表达，抑制NLRP3 活性，进而抑制炎症反应。

综上所述，黄芩苷可通过下调促炎因子IL⁃1β、TNF⁃α 水平，上调抑炎因子IL⁃10 水平，以缓解脓毒症ALI 大鼠肺损伤，可能与miR⁃223⁃3p／NLRP3 通路有关。