显微镜下多血管炎患者血浆外泌体中差异表达的miRNAs及其功能分析①

闫秋爽 王 阳 魏鑫岳 魏 蔚 马 骏 郑 芳（天津医科大学医学检验学院，天津300203）

显微镜下多血管炎（microscopic polyangiitis，MPA）是一类主要表现为小血管损伤的系统性自身免疫疾病。MPA是抗中性粒细胞胞浆抗体（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相关性血管炎（ANCA associated vasculitis，AAV）的亚型，主要特征为血清中存在髓过氧化物酶自身抗体（myeloperoxidase-ANCA，MPO-ANCA）［1］。外泌体是由脂质双分子层包裹的微小囊泡，直径约为30～100 nm，可装载DNA、RNA、蛋白和脂质等重要生物分子，可介导相邻及远距离细胞信息传递［2］。外泌体具有特殊的分子标志物，如CD9、CD63、CD81、TSG101和HSP27等［3］。研究表明，外泌体可能在部分自身免疫性疾病发病机制中发挥作用，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等［4-6］。MicroRNAs（miRNAs）是一类序列长度为19～25个核苷酸的非编码RNA，可调节约90%编码蛋白的基因，在多种生物学过程中（如分化、增殖、凋亡和免疫稳态维持等）发挥重要作用［7-9］。研究表明，外泌体来源的miRNAs参与部分疾病病理过程［10］，但血浆外泌体来源的miRNAs在MPA中的作用尚未见报道。本研究检测MPA患者及健康志愿者血浆外泌体miRNAs表达谱，并分析2组研究对象差异表达的miRNAs（DF-miRNAs）及其功能，为进一步揭示外泌体miRNAs与MPA发病机制的内在联系提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选取2018年1月至2019年8月在天津医科大学总医院风湿免疫科就诊的MPA患者46例，男性14例，女性32例，平均年龄（67.8±11.2）岁。选取同期性别和年龄相匹配的健康志愿者54例，男性16例，女性38例，平均年龄（65.7±16.2）岁，临床资料见表1。MPA患者根据2009年ACR分类标准和2012年Chapel-Hill共识会议分类标准进行诊断，排除患有严重感染和并发症的患者。所有血清学特征以MPO升高为主的AAV患者均符合MPA型血管炎临床适应症的综合判断，包括病史、体格检查、血清学检查、活检和血管造影。本研究经天津医科大学总医院伦理委员会批准（IRB2019-KY-147），患者知情同意。

表1 一般临床资料［±s，例（%）］Tab.1 Clinical characteristics［±s，n（%）］

表1 一般临床资料［±s，例（%）］Tab.1 Clinical characteristics［±s，n（%）］

Note：WBC.White blood cell；CRP.C-reactive protein；ESR.Sedimentation rate；BVAS.Birmingham Vasculitis Activity；ENT.Ear，nose and throat.

Items Number Age（year）Sex Female Male Hemoglobin（g/L）WBC（109 L-1）CRP（mg/L）ESR（mm/L）Creatinine（μmol/L）Ureaprotein（mg/24 h）MPO-ANCA（RU/ml）BVAS Organ involvement ENT Kidney Lung Central nervous system MPA 46 67.8±11.2 32 14 111.8±14.8 11.0±3.5 43.3±37.9 52.9±22.7 242.1±103.0 462.7±387.6 166.6±79.4 19.1±4.4 9（19.6）44（95.7）42（91.3）6（13.0）NC 54 65.7±16.2 38 16 134.2±4.6 6.3±2.9- - - - - - - - - -

1.1.2 主要试剂与仪器 BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；PVDF膜购自Millipore公司；鼠抗CD63购自Santa Cruz公司；兔抗TSG101购自Abcam公司；血浆外泌体总RNA提取试剂盒miRNeasy Micro Kit购自Qiagen公司；超速离心机购自Beckman公司；透射电子显微镜购自日立公司；在illumina HiSeqTM2500/MiSeq平台进行高通量测序。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有血浆样品均取自天津医科大学总医院，采用含抗凝血剂EDTA的真空采血管收集全血，4℃静置4 h，5 000 g离心5 min，-80℃储存。

1.2.2 外泌体分离和纯化 血浆依次离心（4℃），3 000 g离心15 min，6 000 g离心15 min，10 000 g离心30 min（重复1次），去除细胞、细胞碎片和聚集体。上清经0.22μm无菌滤膜过滤，PBS稀释，100 000 g、4℃超速离心70 min（重复1次），得到的沉淀即为外泌体，PBS重悬，-80℃备用。

1.2.3 透射电镜进行外泌体形态超微鉴定 外泌体悬浮液固定于铜网格上，4%多聚甲醛固定，PBS洗涤，4%乙酸铀酰固定，透射电子显微镜观察。

1.2.4 Western blot法检测外泌体表面标志物CD63和TSG101表达 提取血浆外泌体总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，12%SDS-PAGE分离蛋白，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。加入一抗鼠抗CD63、兔抗TSG101，4℃孵育过夜，加入相应二抗室温孵育1 h，检测蛋白表达。

1.2.5 外泌体miRNAs表达及差异分析 从外泌体悬浮液中提取总RNA，按照miRNeasy Micro Kit试剂盒说明书操作，对提取样本进行RNA质检及高通量测序，并进行定性和定量分析，统计各样本中miRNAs表 达，采 用TPM（transcripts per million reads，TPM）进行表达量归一化处理［11］。检验样品间基因表达水平相关性。采用基于负二项分布的DESeq2分析2组中表达水平显著差异的miRNAs，当差异倍数（FC）绝对值＞2且P＜0.05时为差异显著［12］。

1.2.6 DF-miRNAs靶基因预测及功能分析 为提高靶基因预测准确性，采用miRanda、PITA和RNAhybrid软件对DF-miRNAs靶基因进行预测分析，并将3个软件分析结果中均存在的靶基因定义为相应miRNA的潜在靶基因。进一步对获得的DF-miRNAs靶基因进行GO（Gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析［13-14］。

2 结果

2.1 血浆外泌体鉴定 电镜观察显示，超速离心分离获得的血浆微囊泡为直径30～100 nm的不规则球体，具有相对完整的脂质双分子膜（图1A）。Western blot结果显示，患者和健康志愿者血浆微囊泡均表达CD63和TSG101（图1B）。提示超速离心法从血浆中获得的微囊泡为外泌体。

图1 血浆外泌体鉴定Fig.1 Identification of plasma exosomes

2.2 血浆外泌体来源RNA高通量测序及测序数据质量评估 采用illumina HiSeqTM2500/MiSeq平台进行高通量测序，得到的原始数据文件分析转化为测序序列（Raw reads），并对测序数据质量进行评估（图2）。测序错误率分布检查用于分析目的测序范围（1～40个碱基）测序错误率异常的碱基位置。每个碱基位置的测序错误率低于0.5%为测序数据质量良好。结果显示目的测序范围内，6个测序样本测序错误率低于0.5%，表明测序数据准确可靠。

图2 实验样本测序错误率分布Fig.2 Distribution of sequencing error rate of experimental samples

2.3 测序数据过滤 Clean reads是对Raw reads进行处理后得到的干净数据，后续统计分析均基于此数据。对Raw reads进行处理是由于其含有带接头的、低质量的reads，未经过滤会影响信息分析质量。miRNA长度集中于21～22个核苷酸，因此在各样品的Clean reads中筛选了长度为21～22个核苷酸的小RNA（sRNA）进行分析。经sRNA长度分析筛选后，各样本得到的总reads数为Total sRNA。样本匹配到已知miRNA前体的sRNA个数为Mapped total sRNA，具体数据见表2。

表2 实验样本高通量测序数据汇总Tab.2 Summary of high-throughput sequencing data of experimental samples

2.4 筛选差异表达的miRNAs 根据差异表达miRNAs的整体分布，从FC值和P值2个水平进行评估，筛选差异表达miRNAs，结果显示，MPA组与健康对照组相比，32个血浆外泌体来源miRNAs表达水平有显著差异，其中12个表达显著上调，20个表达显著下调（表3）。

表3 MPA患者血浆外泌体中差异表达的miRNAs（部分）Tab.3 Differentially expressed miRNAs in MPA-exo（part）

2.5 差异表达的miRNAs靶基因功能分析 MPA中表达上调的miRNAs组中，GO-BP分析显示，差异表达的miRNAs靶基因功能与树突发育调节、物质运输、细胞过程的正向调控等生物学过程相关；GOCC分析显示，靶基因转录产物与细胞质、细胞器等细胞组分相关；GO-MF分析中靶基因功能主要与蛋白结合显著相关（图3A）。而在MPA中表达下调的miRNAs组中，GO-BP分析显示，靶基因功能在单一生物学过程、细胞组分正向调控等方面富集；GO-CC分析表明靶基因转录产物与神经、突触部分相关；GO-MF分析中靶基因功能与蛋白域特异性结合、蛋白结合等密切相关（图3B）。KEGG富集分析用于预测差异表达miRNAs的靶基因影响的信号通路，上调的miRNA靶基因主要富集于Toll样受体（Tolllike receptor，TLR）信号通路、TNF信号通路、溶酶体和AMPK信号通路等（图4A）。下调的miRNA靶基因主要参与代谢相关信号通路、p53信号通路、MAPK信号通路、胰岛素信号通路及氨基酸生物合成等（图4B）。

图3 差异表达的miRNAs靶基因的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis for target genes of differentially expressed miRNAs

图4 差异表达的miRNAs靶基因KEGG途径分析Fig.4 KEGG pathway analysis for target genes of differentially expressed miRNAs

3 讨论

本研究首次探究了MPA血浆中外泌体来源miRNAs的差异表达及其在病理机制中的潜在功能，通过超速离心分离得到MPA患者和健康志愿者的血浆外泌体并进行鉴定，高通量测序分析发现MPA组与健康对照组相比，血浆外泌体有32个表达显著差异miRNAs，进一步对DF-miRNAs进行靶基因预测及其靶基因的功能分析，结果显示MPA中差异表达的血浆外泌体miRNA可能在疾病代谢、免疫和炎症方面发挥作用。

几乎所有细胞都可以分泌外泌体，因此各种体液中都可以检测到外泌体［15］。本研究通过超速离心法首次分离得到MPA患者血浆外泌体，并采用透射电镜和Western blot法对外泌体进行鉴定，超微形态学观察和外泌体标记蛋白CD63和TSG101检测结果显示，分离得到的细胞外微囊泡为外泌体。为进一步研究MPA患者血浆外泌体miRNAs奠定了基础。

本研究通过高通量测序法检测MPA和健康志愿者血浆外泌体miRNA表达谱并进行比较，发现2者差异显著。MPA组有32个血浆外泌体来源miRNAs表达显著改变，其中12个表达显著上调，20个表达显著下调。部分DF-miRNAs在多种疾病中发挥重要作用，如循环miR-103a-3p可通过SNRK/NFκB/p65调节轴促成血管紧张素II诱导的肾脏炎症和纤维化；心力衰竭患者外泌体中miR-21-5p失调可影响其再生潜能；miR-150-5p通过靶向HMGA2和β-Catenin信号抑制非小细胞肺癌转移和复发等［16-18］。但目前MPA的发病机制尚未阐明，差异表达的miRNAs在MPA疾病过程中的作用鲜有报道，且外泌体来源miRNA在MPA中尚未见报道，有待进一步研究。

GO分析用于注释和推测差异表达的外泌体miRNAs可能涉及的生理功能。当差异表达的miRNAs的靶基因富含这些GOterms时，提示靶基因的功能与之相关。GOterms有3种基本分类，分别为生物学过程（biological process，BP），细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF），从不同层面解释目标基因的生物学功能。MPA血浆外泌体来源的差异表达miRNA靶基因GO富集分析显示，GO-BP分析中miRNA靶基因主要富集于细胞过程等生物学过程；GO-CC分析中miRNA靶基因主要富集于细胞内和胞质组分；GO-MF分析中miRNA靶基因主要富集于蛋白结合相关的分子功能。KEGG富集分析显示，MPA患者血浆差异表达的miRNAs靶基因参与多个生物学途径，其中，相关性最高的途径为代谢途径，且靶基因显著富集于MAPK和TLR信号通路等。代谢、MAPK和TLR信号通路均参与MPA疾病发生发展过程。研究表明，代谢综合征发病率在MPA患者中明显提高，并与MPA患者促炎状态和疾病复发显著相关［19］。研究发现，p38 MAPK激活是MPO-ANCA抗原易位至细胞膜表面的关键步骤［20］。此外，AAV中，HMGB1可通过TLR增强MPO-ANCA诱导的NETs生成［21］。由此推测，MPA血浆外泌体差异表达miRNAs可能在该疾病代谢、炎症和免疫调节方面发挥重要作用。

综上所述，本研究首次鉴定了MPA患者血浆外泌体中的差异表达miRNAs，通过生物信息学分析对差异表达miRNAs的潜在功能进行预测，推测其可能在MPA代谢、炎症和免疫调节方面发挥重要作用，但差异表达miRNAs在MPA中作用的分子模式需进一步研究。本研究拓宽了MPA病理机制研究的视野，为阐明MPA发病机制和寻找潜在治疗靶点提供新方向。