改良SELEX技术筛选福氏志贺菌2a特异性适配体①

王国臻 王玉格 兰春阳 李 翔 李明成 付桂莲（北华大学医学技术学院，吉林132013）

细菌性痢疾主要流行于卫生条件较差的发展中国家，全世界每年的病例总数高达1.647亿，死亡人数超过了60万人［1］，在发展中国家大多数细菌性痢疾由福氏志贺菌（占60%）引起，在我国最为流行的是福氏和宋内志贺菌［2］，主要检测方法有分离培养法、免疫学及分子生物学等方法。这些方法存在灵敏度低、成本高、耗时长、操作繁琐等缺点。因此建立一种快速、稳定、高效、特异性高、价格低的检测技术，对痢疾防治和临床用药都具有十分重要的意义［3］。

适配体是一种新型的分子识别元件，原理是基于指数富集技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）从随机寡核苷酸文库中筛选对靶物质具有高亲和性与高特异性的寡核苷酸序列单链DNA（ssDNA）或RNA［4］。与传统抗体相比，适配体优点是识别的靶分子范围广，可以与各种肿瘤细胞、细菌、蛋白质多肽、金属离子和病理切片等进行结合识别；有较高的特异性和亲和性；识别精细的抗原结构，也可鉴别交叉抗原；易于修饰，可大量和快速在体外合成。筛选周期短、成本低，比起抗体的制备，尤其是单克隆抗体的制备，整体制备周期缩短了60%以上的时间［5］。全细菌消减SELEX技术（whole-bacteria SELEX）是一种以完整细菌为靶标的筛选方法，经过12～15轮的筛选，中间采用消减菌筛选技术，即用与其种属相近、致病性相似的菌进行反向筛选，增强其特异性。目前，全细菌SELEX技术已经成功筛选出多种适配体，包括肠炎沙门氏菌、化脓性链球菌等适配体，实验证明适配体可显著抑制细菌侵入宿主细胞，发挥抗微生物感染的功效［6］。

本研究采用whole-bacteria SELEX技术制备福氏志贺菌2a特异性核酸适配体，在制备适配体过程中，首次应用Lambda外切酶切割dsDNA获得ssDNA，应用Sephacryl凝胶层析技术将dsDNA、ssDNA和酶切碎片进行分离，极大缩短适配体的制备时间，同时可有效提高核酸适配体的特异性。本研究建立的核酸适配体制备技术，为适配体的广泛应用起到示范推广作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 福氏志贺菌2a（CICC：21534）由吉林市疾控中心提供；肠炎沙门氏菌（CICC：21482）、大肠埃希菌（ATCC：25922）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）；大肠埃希菌DH5α感受态细胞、质粒GUPXT19-TVector购自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要试剂和仪器 1×结合缓冲液（Banding Buffer，BB；主要成分：Tris-base、酵母tRNA、牛血清白蛋白）购自北京天根生化科技有限公司；基因扩增仪购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司；LB液体培养基购自Sigma公司；高速冷冻离心机、分析天平购自德国Sartorius公司；流式细胞仪购自北京艾格斯生物科技有限公司；微量核酸分析仪购自美国Quwell公司。

1.2 方法

1.2.1 核酸适配体初级文库（ssDNA）的制备 福氏志贺菌2a核酸适配体初级文库参考文献设计，由Gene公司采用随机引物合成法合成［7］。随机ssDNA文库全长为76 nt，其两端为固定引物序列，上游引物序列为5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'，下游引物为5'-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'，中间为35个碱基的随机序列。用BB稀释至10 nmol/μl，配制成贮存液，使用时用双蒸水进行10倍稀释。混匀后放入EP管中，95℃加热5 min，置于冰上备用。

1.2.2 靶标菌与消减菌的制备 分别挑取福氏志贺菌、大肠埃希菌、沙门菌接种到30 ml LB液体培养基中，置于37℃、50 r/min，振荡培养至对数生长期（A600=0.3），收集菌液，6 000 r/min离心5 min，弃上清，用1×BB洗涤沉淀3次，重悬于500μl BB中。

1.2.3 ssDNA文库与福氏志贺菌2a细胞淘选 将制备好的适配体初级文库与靶标菌结合，设定反应总体系为500μl，ssDNA文库为2 nmol，细菌总量为107cfu/ml，37℃、180 r/min孵育1 h，3 500 r/min离心5 min，弃上清，用BB洗两次。95℃热变性10 min，立即冰浴10 min，4℃、8 000 r/min离心7 min，获得的上清即为该轮筛选的产物。

1.2.4 PCR大量扩增及条件优化 通过梯度PCR扩增上清液中的ssDNA，制备高纯度dsDNA。设定PCR体系为12.5 ml（2×Taqmix 6.25 ml，上游引物0.5 ml，下游引物0.5 ml，去离子双蒸水2.25 ml，模板3 ml），分别将模板进行5×、10×、20×稀释，循环数设定为6 cycle、8 cycle、10 cycle、12 cycle。最后放大PCR体系至100 ml，挑选在无污迹、无非特异性扩增的优化条件下产生的dsDNA，并在下游引物进行磷酸标记，用于外切酶的识别。

1.2.5 Lambda外切酶酶切及葡聚糖凝胶（Sephacryl）纯化 利用Lambda外切酶可以识别下游引物5′端带磷酸的dsDNA，将dsDNA切割成ssDNA。反应体系及条件：Lambda外切酶2μl，去离子双蒸水18μl，pH=9.4，37℃，10 min。制备葡聚糖凝胶层析柱，提前1 d用双蒸水泡发好Sephacryl凝胶，按照长度L与直径D的比值（L/D=10），装入层析柱中铺匀，长度L达到20 cm左右，用于PCR产物和酶切产物的纯化。酶切产物上样量200μl，间断用去离子双蒸水冲柱，加入上样量2倍体积，2～3 s 1滴，1滴约为22μl，用96孔板收集，微量紫外分析仪检测，绘制回收曲线。

1.2.6 次级ssDNAs文库的制备 取12μg回收的ssDNA，醇沉，重悬于500μl BB中，置于95℃水浴10 min后，迅速置于冰上10 min，在4℃的条件下恢复其空间结构，作为下一轮筛选的次级文库。

1.2.7 消减菌的使用 分别在3、4、5轮加入肠炎沙门菌进行反向筛选，6、7、8轮加入大埃希菌进行反向筛选，消减菌保证了福氏志贺菌适配体的特异性。

1.2.8 克隆测序 将40μl X-gal和16μl IPTG 20 ml均匀的铺在LB固体培养基上，将适配体连接到GU PXT19-T Vector上，转化感受态细胞DH5α，蓝白筛选，挑去白色菌落，送到上海生工工程股份有限公司进行测序。

1.2.9 志贺菌适配体亲和性的检测 将上游引物5′端标记磷酸，通过PCR扩增产生带荧光dsDNA，避光条件下，通过Lambda外切酶进行酶切，酶切产物用Sephcryl凝胶层析纯化后。取40μl 107cfu/ml福氏志贺菌，与10μl 100 ng/μl选取的自由能较小的几条适配体进行孵育，用流式细胞仪检测适配体结合荧光强度，从而筛选出亲缘性高、特异性强、结合荧光能力强的适配体。

2 结果

2.1 PCR扩增ssDNA的筛选条件优化 将模板进行梯度稀释，选择5倍、10倍及20倍稀释，同时分别进行6 cycle、8 cycle、10 cycle、12 cycle循环，共设定16组条件，找到最适宜的扩增条件。结果当模板10倍稀释时，10个循环的条件下能够扩增出单一目的条带，将这一轮筛选出来的ssDNA全部扩增（图1）。

图1 PCR大量扩增ssDNA优化条件琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Agarose gel electrophoresis of largely amplifying ssDNA by PCR in optimized conditions

2.2 Lambda外切酶切割dsDNA反应条件 重复酶切试验证明最适宜反应体系为20μl体系。分别选择酶切底物浓度为700 ng/μl、600 ng/μl、500 ng/μl；Lambda外切酶为2μl，10×缓冲液2μl，去离子双蒸水补齐。将实验分为两组：1倍酶量和2倍酶量（20μl反应体系中，外切酶量4μl），时间设定15 min和30 min。结果显示底物为700 ng/μl、600 ng/μl，2倍酶量进行酶切，反应时间为30 min时，可获得单一目的条带。随着酶切时间过长，也会缓慢降解ssDNA，产生非磷酸化底物（图2）。

图2 不同浓度、不同酶量PCR产物酶切效果的变性聚丙烯凝胶电泳图Fig.2 Denaturing polypropylene gel electrophoresis of PCR products with different concentration and enzyme activity

2.3 Sephacryl凝胶层析纯化及Lambda外切酶酶切产物回收曲线 设计实验模仿酶切混合物，将100 ng/μl dsDNA和100 ng/μl ssDNA以2∶1比例混合共300μl，绘制回收曲线（图3）。按照公式计算：回收率=实际回收ssDNA量/加入ssDNA估计的量×100%，结果ssDNA回收率高达84.40%，说明Sephacryl凝胶层析柱可以回收纯化ssDNA产物。按此方法，回收600 ng/μl酶切混合物150μl，平均回收率高达72.33%（图4）。

图3 微量紫外分析仪检测实验模仿酶切混合物ssDNA回收曲线Fig.3 Recovery curve of ssDNA detected from mimic mixtures after enzyme digestion by micro UV analyzer

图4 微量紫外分析仪检测600 ng/μl酶切混合物ssDNA回收曲线Fig.4 Recovery curve of ssDNA detected from 600 ng/μl mixtures after enzyme digestion by micro UV analyzer

2.4 适配体一级结构 福氏志贺菌2a的ssDNA经过10轮正向筛选和6轮消减菌筛选，最终得到第九轮与第十轮荧光强度基本完全相同，通过荧光分光光度计最终确认完成富集。将得到特异适配体与T载体连接，转化到DH5α感受态细胞中，蓝白斑筛选，挑去60个白色菌落进行测序。应用MEGA 5.0对测序回来的随机序列进行同源性分析，将适配体分为3大族，选取3个家族同源性较高的有代表性的3个序列，分别命名为ZH-17、ZH-21、ZH-28（图5）。

图5 福氏志贺菌2a适配体同源性分析Fig.5 Homology analysisof aptamersof Shigellaflexneri2a

2.5 核酸适配体的亲和性 选取3条结合特异性好的适配体，分别与福氏志贺菌2a进行孵育，经过流式细胞仪分析，适配体ZH-21与志贺菌结合亲和性最好，荧光强度最高，而与种属相近的两种消减菌肠炎沙门菌和大肠埃希菌结合能力弱（图6、7）。

图6 福氏志贺菌3条亲和性高适配体流式细胞仪荧光强度比对Fig.6 Comparison of fluorescence intensity of three highly compatible ligands of Shigella flexneri by flow cytometry

2.6 适配体的二级结构 将3个代表序列输入预测DNA和RNA的二级结构在线工具mfold（http：//unafold.rna.albany.edu/？q=mfold），得到了ZH-17、ZH-21和ZH-28三个适配体的空间结构和自由能，根据流式细胞仪实验结果，ZH-21结合特异性最高，测序其一级结构为ATCCAGAGTGACGCAGCACGCACACACCTTCTTTCTTTCTGTCCCCTTCTTTCTTTCCTGGACACGGTGGCTTAGT，其二级结构自由能小且有发卡、茎环和凸环等结构（图8）。

图7 ZH-21适配体与志贺菌、肠炎沙门菌、大肠埃希菌的结合比对Fig.7 Comparison of bingding ratio for aptamer ZH-21 to Shigella，Samonella enteritidis and Escherichia coli

图8 福氏志贺菌亲和性最高适配体ZH-21二级结构Fig.8 Secondary structure of the highest affinity ligand ZH-21 of Shigella flexneri

3 讨论

志贺菌常规检验技术包括有增菌培养、分离纯化、生化检验和血清型分型鉴定等，为了得到最好的分离效果，定性检测实验中同时采用低敏感性麦康凯培养基、强选择性木糖赖氨酸去氧胆酸钠培养基或HE培养基来提高检出率，且应该对沙门菌-志贺菌分离培养基（SS）谨慎使用，因其会抑制某一些志贺菌1型的生长，对其检测结果造成误差。ELISA法特异性强、灵敏度高、重复性强、准确度好且易于自动化操作，但试剂专一性强，无法同时检测出多种成分，且会出现与结构类似化合物结合交叉反应，此外，特异抗体还受制备、保存、温度、时间、环境和保存方法的影响，故限制了其应用［8］。PCR技术包括常规PCR、多重PCR、荧光定量PCR等，缩短了相应的检测时间，且可以对多种菌同时进行检测，但其操作易产生污染，出现假阳性，且DNA和RNA易被降解，从而影响实验结果［9］。对志贺菌的常规检测技术存在着操作繁琐且特异性低，难以满足公众对大批量人体健康体检和突发性公众卫生事件的需求［10］。

传统制备适配体过程中，主要采用离心沉淀法或使用Streptavidin Sepharose碱变性亲和层析柱将与靶标结合和未结合的寡核苷酸序列分离，这种适配体制备时间需要5～6 d，层析柱分离法成本高，存在着提高特异性和大规模制备的技术障碍［11］。在整个适配体筛选过程中，ssDNA文库的产量与特异性对适配体筛选至关重要。本实验利用Lambda核酸外切酶可以作用于双链DNA，联合Sephacryl凝胶层析获得ssDNA和非磷酸化底物。凝胶层析又被称为分子筛过滤、排阻层析等，它突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体、不带电荷、吸附力弱、操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，凝胶层析技术多用于蛋白质等大分子有机物的分离。Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（N，N'-methylenebisacrylamide）交联而形成的，是一种新型葡聚糖凝胶，分离范围极大，机械稳定性高［12］。本实验引入Sephacryl凝胶层析技术纯化ssDNA混合物，摸索了小剂量和大剂量制备适配体Lambda酶与dsDNA最佳工作条件。进行大规模制备时，回收效率高达70%以上，而传统琼脂糖凝胶切胶回收效率只有10%左右［13］。

实验首次将Lambda外切酶和Sephacryl凝胶层析技术应用于适配体ssDNA和酶切碎片筛选，极大缩短了适配体的制备时间，同时可有效提高核酸适配体的特异性。提高了适配体的制备效率，增加了适配体的结合特异性，将整个制备周期缩短至3～4 d，且尤其适用于工厂、公司大规模制备适配体，该技术极大地推广了适配体的大规模使用。

福氏志贺菌2a是中国地区常致感染性腹泻的病原菌，因此快速、有效的应用适配体检测志贺菌技术，也对疾病防治和临床选择用药具有十分重要的意义［14］。但本研究尚不能为该适配体的其他3种志贺菌进行特异性检测。为了优化适配体的制备，保证其特异性，下一步我们计划利用生物信息技术比对靶标菌的特异性蛋白质，通过蛋白质工程技术和蛋白质空间结构来反向设计适配体的一级结构和二级结构，将其命名为限制性指数富集技术，意为将设计好的若干种适配体与靶标菌进行结合，极大地提高其特异性和筛选效率。