LncRNA AC010145.4在原发性肝细胞癌组织中的表达及对细胞增殖、侵袭的影响

郭 勇 李 波 蒲邦明 方 超 李春桃（西南医科大学附属中医医院肝胆外科，泸州646000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大最常见的肿瘤，居全球肿瘤相关死亡原因的第三位［1］。HCC在原发性肝癌患者中占90%以上。其预后较差，5年生存率仅为17%～53%［2-3］。目前，HCC的根治性手术治疗仅在疾病早期阶段有效，但大多数患者在诊断时就已处于晚期，失去了手术机会。研究发现，肿瘤复发和转移率高是导致HCC患者预后不良的主要因素。因此，迫切需要对HCC机制的新见解，以确定新的预后分子标志物和潜在的有效治疗靶点，从而提高患者的存活率［4-5］。长链非编码RNA（long noncoding RNAs，LncRNA）是一类长度超过200个碱基对的RNA转录产物，表现出有限的蛋白质编码能力。许多LncRNA在分化的组织或特定的癌症类型中特异性表达［6-7］。近期研究发现，LncRNA通过与其他细胞大分子相互作用驱动许多重要的癌症表型，如DNA、RNA和蛋白质［8］。也有研究发现，异常的LncRNA表达在肝癌的发生和转移中起关键作用［9-10］。有研究者发现，LncRNA AC010145.4参与调节小细胞肺癌的发生和发展，然而关于LncRNA AC010145.4在原发性肝细胞癌中的表达及意义的研究却十分有限［11］。本研究拟分析HCC癌组织中LncRNA AC010145.4的表达，并观察其对人肝癌细胞SMMC-7721和HCCLM3细胞活力和侵袭能力的影响，以期为HCC的机制研究提供基础资料。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取2014年1月至2016年1月于我院接受手术切除术的HCC患者131例作为研究对象，收集患者相关病例资料、愈后情况。纳入标准：①术后病理证实为HCC；②术前未接受抗肿瘤治疗；③接受完全肿瘤切除术。排除标准：①院内死亡；②合并其他恶性肿瘤者；③病例资料不全者。本研究经我院伦理委员会批准，所有研究对象在参与本研究前均已签署知情同意书。

1.1.2 细胞来源 HCC细胞系SMMC-7721和HCCLM3均购自于美国菌种保藏中心。SMMC-7721和HCCLM3细胞系均在5%CO2、37℃条件下培养于RPMI1640细胞培养基。

1.1.3 主要试剂与仪器RPMI1640细胞培养基购自北京友康恒业生物科技有限公司；慢病毒转染系统由上海吉玛生物技术有限公司设计合成；Trizol试剂盒、Prime Script RT试剂盒、SYBR premix ex TaqtmⅡ试剂盒购自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。Stratagene MX3005P实时荧光定量PCR仪购自美国安捷伦。

1.2 方法

1.2.1 LncRNA AC010145.4相对表达量测量 分别取50 mg癌组织和癌旁组织样本进行超声匀浆，Trizol试剂盒提取HCC癌组织和癌旁组中的总RNA，并逆转录为cDNA。按照SYBR premix ex TaqtmⅡ试剂盒说明书进行qRT-PCR实验检测LncRNA AC010145.4表达。PCR反应条件如下：95℃预变性10 min；（95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s）×40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算LncRNA AC010145.4的相对表达水平。

1.2.2 慢病毒转染LncRNA AC010145.4 siRNA SMMC-7721和HCCLM3细胞系消化和传代时间为48 h，实验采用对数生长相细胞。将SMMC-7721和HCCLM3细胞接种于6孔板，并培养直至达60%融合。去除6孔板中的血清，Lipofectamine 2000分别转染经慢病毒包装的siRNA（沉默表达组，siRNA组）和空载体（阴性对照组，Ctrl组）。继续培养48 h后进行相关研究。

1.2.3 细胞增殖能力测定 将siRNA组和Ctrl组对数生长期的SMMC-7721和HCCLM3细胞系接种于96孔板（3 000个/孔），分别培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h。在添加CCK-8之前，改变培养基。每孔加入90μl培养基和10μl CCK-8。使用微孔板读数器测定450 nm处的OD值。并绘制细胞增殖曲线。

1.2.4 细胞侵袭能力测定 取siRNA组和Ctrl组对数生长期的SMMC-7721和HCCLM3细胞进行细胞悬浮。将细胞密度调整为1×104个/ml，并将100μl细胞悬浮液添加至Transwell室。然后将800μl培养基（带有转染复合物或NC）加入下室的24孔板。培养24 h后，移除Transwell室，PBS冲洗后，福尔马林固定细胞。用棉签擦拭微孔膜上细胞，结晶紫染色。在显微镜下，将图像放大200倍以计算每个区域的侵袭细胞数。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0软件进行统计分析，首先进行数据的正态分布检测，数据均为正态分布。计量资料用±s表示，组间比较采用t检验。计数资料用频数（%）表示，组间比较采用卡方检验。采用受试者工作特征曲线（ROC）计算LncRNA AC010145.4对HCC患者术后生存的预测价值。采用Kaplan-Meier并Log-rank检验比较LncRNA AC010145.4表达对HCC患者术后总体生存时间的影响。COX回归模型分析影响HCC患者术后生存的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC癌组织中LncRNA AC010145.4表达 通过RT-qPCR检测HCC患者的癌旁组织和癌组织中LncRNA AC010145.4的相对表达量，结果发现，与癌旁组织相比，HCC癌组织中的LncRNA AC010145.4表达显著升高（9.13±2.43 vs 1.33±0.40），差异有统计学意义。见图1。

图1 HCC患者癌组织和癌旁组织中LncRNA AC010145.4的表达差异Fig.1 Different expression of LncRNA AC010145.4 in cancer and paracancerous tissuesof HCC patients

2.2 LncRNA AC010145.4表达对HCC患者的诊断价值 如图2所示，LncRNA AC010145.4对预测HCC患者术后死亡的最佳临界值为5.98，灵敏度为94.2%，特异度为67.7%，AUC为0.775，95%CI：0.69～0.84（P＜0.05）。

图2 LncRNA AC010145.4预测HCC患者术后死亡的ROC曲线Fig.2 ROC curve of LncRNA AC010145.4 to predict postoperative mortality in HCC patients

2.3 LncRNA AC010145.4表达与临床病理特征关系 根据ROC曲线结果，将LncRNA AC010145.4表达水平高于5.98者定义为高表达组（n=73），将LncRNA AC010145.4表达水平低于5.98者定义为低表达组（n=58），分析LncRNAAC010145.4相对表达量与HCC患者的临床病理特征关系，结果如表1。LncRNA AC0 10145.4表达与患者的性别、年龄、门冬氨酸转移酶无显著相关性（P＞0.05），而与谷丙转氨酶、甲胎蛋白、Child-Pugh分级、是否感染肝炎病毒、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期显著相关（P＜0.05）。

表1 HCC患者LncRNA AC010145.4相对表达量与临床病理特征的关系［例（%）］Tab.1 Relationship between relative expression of LncRNA AC010145.4 and clinicopathological characteristicsin HCC patients［n（%）］

2.4 HCC患者单因素生存分析结果 如图3、表2，单因素生存分析显示，较高甲胎蛋白水平、Child-Pugh分级B级、较大肿瘤直径、淋巴结转移、较高TNM分期、LncRNA AC010145.4高是经手术治疗HCC患者死亡的独立危险因素。

图3 LncRNA AC010145.4相对表达量与HCC患者术后生存率相关性Fig.3 Correlation between relative expression of LncRNA AC010145.4 and postoperative survival rate of HCC patients

表2 HCC患者术后生存率单因素及多因素回归分析Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analysis for HCC patients

2.5 HCC患者Cox回归分析结果 将单因素生存分析显示差异有统计学意义的变量纳入Cox回归模型进行分析得出：较高甲胎蛋白水平、Child-Pugh分级B级、较大肿瘤直径、淋巴结转移、较高TNM分期、LncRNA AC010145.4高是经手术治疗HCC患者死亡的独立危险因素。见表2。

2.6 沉默LncRNA AC010145.4表达抑制肝细胞癌增殖 由图4可知，siRNA组细胞增殖活力较Ctrl组明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明沉默LncRNA AC010145.4表达能抑制SMMC-7721和HCCLM3细胞的增殖能力。

图4 Ctrl组与siRNA组的细胞增殖曲线比较Fig.4 Comparison of cell proliferation curve between Ctrl and siRNA group

2.7 沉默LncRNA AC010145.4表达抑制肝细胞癌侵袭 Transwell实验表明，在×200的视野下，SMMC7721细胞siRNA组侵袭细胞数为（33±6）×103个，Ctrl组侵袭细胞数为（98±23）×103个；HCCLM3细胞siRNA组侵袭细胞数为（30±5）×103个，Ctrl组侵袭细胞数为（90±20）×103个；两种细胞siRNA组侵袭细胞数均显著低于Ctrl组（均P＜0.05）。结果见图5。

图5 沉默LncRNA AC010145.4抑制HCC侵袭（×200）Fig.5 Silence of LncRNA AC010145.4 inhibit HCC invasion（×200）

3 讨论

HCC是全球范围内癌症相关死亡的主要原因之一，其发生发展机制十分复杂，临床上尚未发现可靠的HCC治疗靶点。研究发现，肿瘤复发和转移是导致HCC患者预后不良的主要原因。有研究者认为，单纯DNA突变并不能完全解释HCC发生发展的复杂进程［12］。目前，基因不同水平表达调控机制研究是诊断和治疗HCC的热点。LncRNA是一类长度超过200个碱基对但不编码蛋白质的非编码RNA。人类基因组中LncRNA的确切数目仍存在争议，但有研究者认为人类基因组中有超过60 000个LncRNA。最近研究发现，LncRNA是多种生物学过程中的重要分子，包括发育、表观遗传学、干细胞生物学、激素反应、癌症和脑功能等。

既往研究发现，LncRNA在HCC患者的发生发展中发挥重要作用［8，13］。DING等［14］的研究发现，LncRNA PVT1在肝癌组织中表达升高，且其表达升高可增加肝癌复发的发生风险。LncRNA CCAT1在肝癌组织中高表达，且与临床分期和肿瘤大小相关，是影响肝癌患者预后的独立危险因子［15］。ZHANG等［16］发现，LncRNA SNHG15在肝癌组织中表达上调，且LncRNA SNHG15表达与肝癌分级、血管侵犯、TNM分期及预后相关。刘浩等［17］研究发现，LncRNA AC010145.4在直肠癌组织中相对表达量升高，可能是评估直肠癌患者预后的潜在分子标志物。然而，目前尚未发现LncRNA AC010145.4表达对HCC患者的影响。本研究发现，LncRNA AC010145.4在HCC癌组织中的相对表达量显著高于癌旁组织，提示LncRNA AC010145.4可能在HCC中高表达。进一步研究LncRNA AC010145.4表达与HCC患者临床病理特征的关系发现，LncRNA AC010145.4表达与HCC患者谷丙转氨酶、甲胎蛋白、Child-Pugh分级、是否感染肝炎病毒、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期有关，与既往研究结果类似。

既往研究发现LncRNA CCAT1是影响肝癌患者预后的独立危险因子［15］。刘浩等［17］报道，LncRNA AC010145.4是评估直肠癌患者预后的潜在分子标志物。赵冲等［11］发现，LncRNA AC010145.4高表达小细胞肺癌患者的总体生存时间和无进展生存时间均短于低表达者。本研究以ROC曲线得出临界值，证实LncRNA AC010145.4低表达组总体生存率显著高于LncRNA AC010145.4高表达组。提示LncRNA AC010145.4可能与疾病进展有关，是HCC患者预后的影响因素之一。

细胞恶性增殖、侵袭及迁移是肿瘤发展过程中的主要特征之一［18-19］。HUANG等［18］研究发现，LncRNA CDKN2B-AS1可通过靶向let-7c-5p/NAP1L1轴促进肝癌细胞的增殖和侵袭。YAN等［20］发现LncRNAmiR31HG可通过靶向miR-575抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。本研究通过CCK-8和Transwell实验发现，SMMC-7721和HCCLM3细胞系上LncRNA AC010145.4沉默表达组OD450nm值显著低于Ctrl组，且侵袭细胞数显著少于Ctrl组，这与HCC癌组织内的结果一致，提示LncRNA AC010145.4沉默表达可能具有抑癌作用。进一步证实了LncRNA AC010145.4可能与HCC病理生理机制相关。

综上所述，本研究首次报道了LncRNA AC010145.4在HCC癌组织中表达升高，且与不良临床病理特征相关。体外试验发现，沉默LncRNA AC010145.4表达可抑制HCC细胞系增殖和侵袭，提示LncRNA AC010145.4在HCC中可能起到促癌基因的作用。然而，影响HCC发生发展的分子机制复杂，LncRNA AC010145.4调节HCC患者发生发展的具体作用机制及参与的信号通路尚需进一步研究。