柚皮素调控NLRP3炎性小体对坏死性小肠结肠炎新生小鼠肠道的保护作用研究

田洪民 王淑屏 王鸿雁 卢宪梅（济南市第三人民医院小儿科，济南250132）

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一种多因素引起的严重威胁新生儿健康的消化系统疾病，能引起严重的肠道炎症，其相关死亡率一直较高（20%～30%）［1］。NLRP3炎性小体（NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3）作为一种蛋白复合物，由上游NLRP3、凋亡相关斑点 样 蛋 白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）以及下游半胱天冬酶-1（Caspase-1）组成。适度激活NLRP3能引起机体固有免疫反应，但过度激活将引发一系列炎症性疾病［2］。研究表明，NLRP3参与NEC发展过程中的炎症反应，因此有效抑制NLRP3炎性小体的活化或许可以为治疗NEC新药的研发提供思路［3］。柚皮素（naringenin，NAR）是一种具有抗炎抗氧化以及抗菌作用的黄酮类化合物，广泛存在于柚、葡萄柚和酸橙中，具有预防心血管疾病、癌症等多种疾病的生理活性［4］。研究发现，柚皮素能通过抑制NLRP3炎性小体激活保护重症急性胰腺炎相关的心肌损伤，但柚皮素是否能通过抑制NLRP3炎性小体介导的炎症反应改善NEC肠道炎症损伤目前尚不明确［5］。因此，本研究拟探讨柚皮素对NEC肠道炎症损伤的作用及其对肠道组织NLRP3炎性小体活化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 柚皮素标准品（纯度＞98%）和脂多糖均购自美国Sigma公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）购自上海碧云天生物技术公司；TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司；逆转录试剂盒购自美国Promega生物公司；抗体兔抗NLRP3、ASC、Caspase-1和GAPDH均购自英国Abcam公司；希玛AR-8100氧气浓度检测仪购自深圳富兰克电子有限公司；荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；酶标仪购自美国Bio-Tek公司；切片机购自德国莱卡公司；聚合酶链式反应热循环仪购自美国Bio-Rad公司。

1.1.2 实验动物 无特定病原体（SPF）级C57BL/6雄鼠和雌鼠均购自广东省医学实验动物中心，动物许可证编号：SCXK（粤）2018-002。饲养温度20～26℃，湿度40%～70%，光照周期12 h/12 h，自由进食和饮水。每周更换一次饲育笼，交配比例雌雄2∶1。

1.2 方法

1.2.1 NEC模型建立及分组 雌鼠自然受孕分娩后，将68只出生3 d的新生小鼠按照随机数字表法分为正常对照组（Control），模型组（NEC），柚皮素低剂量组（L-NAR）和柚皮素高剂量组（H-NAR），每组17只。所有小鼠均母鼠母乳喂养，正常对照组小鼠仅给予等量生理盐水腹腔注射，其他组均采用缺氧冷刺激+LPS腹腔注射法［6］建立NEC模型。柚皮素低、高剂量组小鼠分别予以腹腔注射5 mg/kg、20 mg/kg NAR，1次/d，持续3 d。第5天脱颈致死，取NEC症状最常发生的回肠远端和结肠近端的回盲部肠组织进行后续检测。

1.2.2 小鼠大体观察、临床症状积分以及体重变化 记录新生小鼠的实验前后的体重，并每天观察各组小鼠一般情况并进行统计，一般情况包括：进食、精神活动状态、大便性状、有无腹泻、刺激反应等。临床症状积分从3方面进行评价：①精神活动状态：不间断活动为正常（0分），明显活动减少（1分），在一定刺激下被动活动（2分），对被动活动不敏感（3分）。②大便性状：球形黑便为正常（0分），水分增加成软便（1分），不成形稀糊状便（2分），水样便（3分）。③便血情况：粪便潜血检测阴性（0分），粪便潜血检测阳性（1分），粪便上明显附着血迹且肛门无血迹（2分），血便且肛门口现大量血迹（3分）。

1.2.3 HE染色观察回盲部肠组织病理学变化并评分 取小鼠回盲部肠组织，固定于4%多聚甲醛中24 h，采用浓度梯度乙醇脱水，透明后石蜡包埋，切片机切片，厚度5μm，经苏木精、伊红染色后，脱水封片，在显微镜下观察各组小鼠肠组织病理学变化。参照改良的Nadler标准［7］行双盲法评分，病理评分≥3分视为NEC。

1.2.4 ELISA检测小鼠回盲部肠组织中IL-6、TNFα、IL-1β和IL-18含量 制备各组小鼠回盲部肠组织匀浆，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测量450 nm处光密度（OD）值，根据标准曲线计算肠组织匀浆中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的含量。

1.2.5 qRT-PCR检测 用TRIzol试剂从各组小鼠回盲部肠组织中提取总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，再根据荧光定量PCR试剂盒，配制上样混合物，以cDNA为模板，利用荧光定量PCR仪检测分析NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA表达量。PCR反应条件：95℃10 min，接着95℃15 s，58℃40 s，72℃40 s，循环40次。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算基因的mRNA表达水平。引物序列：NLRP3上游5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游5′-GCTTCAGTCCCACACACAGA-3′；ASC上游5′-GTGTTTACTCTCTGGGATGTTTTTG-3′，下游5′-GTCTGTGGAATTTAGGTGTTGGA-3′；Caspase-1上游5′-TGCCGTGGAGAGAAACAAGG-3′，下游5′-CCCCTGACAGGATGTCTCCA-3′；β-actin上游5′-TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3′，下游5′-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3′。

1.2.6 Western blot检测 将RIPA缓冲液加入剪碎的小鼠回盲部肠组织中，在匀浆器中研磨20 min后，12 000 r/min离心20 min，取上清液即为组织裂解液。再用BCA法测定蛋白质浓度。取适量蛋白煮沸5 min后上样，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离蛋白后将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，TBST洗涤3次，加入一抗NLRP3（1∶200）、ASC（1∶1 000）、Caspase-1（1∶500）和β-actin（1∶1 000），然后将含一抗的膜置于4℃中孵育过夜。再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶5 000），室温孵育1 h。利用超敏ECL化学发光试剂盒对PVDF膜进行显影曝光后，以目的蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值比值表示目的蛋白的表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件对数据进行分析，计量数据均用±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，多组中的两两比较采用LSD-t检验分析。P＜0.05表示组间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠大体观察、临床症状积分以及造模前后体重比较 如表1所示，实验前，4组小鼠一般情况和体重差异无统计学意义（P＞0.05）。实验后，Control组小鼠进食以及排便正常，精神状态良好，体重（2.52±0.15）g，且全部存活，临床症状积分（0.36±0.11）分；NEC组小鼠在NEC造模24 h后逐渐出现精神状态不佳，活动度降低，反应迟钝，腹胀腹泻，血便等情况，且逐渐加重，造模64 h后出现5只小鼠死亡，而NEC组小鼠实验后体重（1.88±0.12）g，临床症状积分为（7.71±1.18）分，较Control组体重明显降低（P＜0.05），临床症状积分明显升高（P＜0.05）。L-NAR组小鼠在NEC造模30 h后逐渐开始出现NEC情况，没有明显改善，造模65 h后出现4只小鼠死亡，且实验后体重为（1.96±0.11）g，临床症状积分为（6.94±1.32）分，较NEC组体重和临床症状积分差异无统计学意义（P＞0.05）。而H-NAR组小鼠在NEC造模45 h后也逐渐出现活动度降低，腹泻腹胀，排黄绿色黏便，但程度较NEC组轻，实验后体重为（2.28±0.18）g，临床症状积分为（4.53±1.07）分，较NEC组的明显升高（P＜0.05），临床症状积分明显降低（P＜0.05），且仅在造模70 h后出现1只死亡。

表1 比较各组小鼠造模前后体重（±s，g）Tab.1 Comparison of body mass of mice in each group before and after modeling（±s，g）

表1 比较各组小鼠造模前后体重（±s，g）Tab.1 Comparison of body mass of mice in each group before and after modeling（±s，g）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with NEC group，2）P＜0.05；compared with beforemodeling，3）P＜0.05.

Groups Control NEC L-NAR H-NAR n 17 17 17 17 Before modeling 1.79±0.10 1.81±0.12 1.78±0.10 1.80±0.11 After modeling 2.52±0.153）1.88±0.121）1.96±0.113）2.28±0.182）3）

2.2 NAR对小鼠肠组织病理变化以及评分的影响 如图1所示，Control组可见完整清晰的回盲部肠组织结构，肠绒毛高耸，肠上皮排列整齐，黏膜层、黏膜下层及固有层均未断裂或肿胀分离；NEC组和H-NAR组可见肠组织结构紊乱，绒毛结构杂乱、脱落甚至消失、肌层变薄甚至断裂；H-NAR组肠组织结构较清晰，绒毛存在部分脱落或断裂，整体较NEC组改善明显；如图2所示，与Control组比较，NEC组病理评分显著升高（P＜0.05）；与NEC组比较，H-NAR组病理评分明显降低（P＜0.05），而LNAR组病理评分差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 HE染色观察小鼠回盲部结肠组织病理变化（×400）Fig.1 HE staining was used to observe pathological changes of ileocecal colon in mice（×400）

图2 比较小鼠回盲部结肠组织病理评分Fig.2 Comparison of histopathological scores of ileocecal colon in mice

2.3 NAR对小鼠肠组织匀浆中炎症因子水平的影响 如表2所示，与Control组比较，NEC组小鼠肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表达水平明显升高（P＜0.05）；与NEC组比较，H-NAR组小鼠肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表达水平显著降低（P＜0.05），而L-NAR组的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组小鼠肠组织中炎症细胞因子的表达水平（±s，pg/ml）Tab.2 Expressions of inflammatory cytokines in intestinal tissues of mice in each group（±s，pg/ml）

表2 各组小鼠肠组织中炎症细胞因子的表达水平（±s，pg/ml）Tab.2 Expressions of inflammatory cytokines in intestinal tissues of mice in each group（±s，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with NECgroup，2）P＜0.05.

Groups Control NEC L-NAR H-NAR n 17 17 17 17 TNF-α 17.62±5.79 66.38±15.111）57.45±13.85 31.42±11.362）IL-6 46.53±17.55 167.31±32.301）144.25±31.40 81.54±22.352）IL-1β 97.55±25.86 352.61±59.701）304.22±67.52 188.52±34.662）IL-18 57.56±25.49 256.77±42.451）222.85±50.56 122.24±38.812）

2.4 NAR对小鼠肠组织NLRP3炎性小体表达的影响 如图3所示，与Control组比较，NEC组小鼠肠组织中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白相对表达量均显著上调（P＜0.05）；与NEC组比较，HNAR组小鼠肠组织中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.05），而L-NAR组的差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组小鼠肠组织NLRP3炎性小体表达检测Fig.3 Expression of NLRP3 in intestinal tissue of mice in each group

3 讨论

多年来，NEC的发病机制被认为是由早产、肠内喂养、肠缺血和细菌效应等几个关键危险因素引起的。此外，在20世纪60年代和70年代有人提出，这些危险因素能刺激肠道或NEC并发其他部位的炎症反应［8］。研究报道称，细菌产物如内毒素（也称脂多糖）与NEC有关，这些细胞膜配体引发炎症反应，导致肠坏死［9］。本研究结果发现，新生NEC小鼠的回盲部肠组织出现严重的炎症反应损伤，并且肠组织炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的表达水平明显升高，其中促炎细胞因子IL-1β和IL-18的含量升高可能是由于NLRP3炎性小体活化并介导Caspase-1表达所致［10］。有研究表明，NLRP3炎性小体能激活Caspase-1，介导炎症因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，可进一步募集和激活其他免疫细胞，增强局部和全身炎症反应［11］。而NLRP3炎性小体的过度活化引起的炎性损伤广泛参与2型糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等多种疾病的发生和发展［12-14］。本研究结果表明，在新生NEC小鼠的肠组织中NLRP3炎性小体活化也异常增高，提示抑制NLRP3炎性小体活化或许能改善NEC小鼠肠道损伤。

众所周知，自然界中广泛存在的天然药物已成为研发新型药物的重要来源。目前已经发现一些天然药物能够通过抑制NLRP3炎性小体活化而发挥作用，比如栀子苷通过抑制坏死病介导的NLRP3炎性小体信号传导，改善了d-半乳糖胺和LPS诱导的肝细胞损伤［15］；竹节参皂苷Ⅳa通过阻断NLRP3/Caspase-1通路对七氟醚诱导的神经炎症具有神经保护作用［16］；丹参酚酸A能抑制主动脉组织NLRP3炎性小体活性，减轻2型糖尿病并发动脉粥样硬化大鼠体内慢性炎症引起的损伤［17］。柚皮素，又称4′，5，7-三羟黄酮，是一种柑橘黄烷酮，是现代社会消耗量最大的类黄酮之一，具有良好的生物利用和医疗应用。已有研究发现，柚皮素能够通过抑制NLRP3炎性小体活化改善重症急性胰腺炎诱导的心肌损伤［5］。本研究结果显示，柚皮素能够下调NEC小鼠肠组织中NLRP3、ASC和Caspase-1等mRNA和蛋白表达水平，表明柚皮素也能够抑制NEC小鼠肠组织中NLRP3炎性小体活化。进一步研究发现，柚皮素还能够降低NEC小鼠肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18等炎症因子表达水平，并且对NEC新生小鼠肠组织损伤具有保护作用，表明柚皮素可能通过抑制NLRP3炎性小体表达，降低肠组织炎症水平，缓解NEC新生小鼠肠组织炎症损伤。

综上所述，柚皮素通过抑制NLRP3炎性小体表达，降低新生NEC小鼠肠组织炎症因子的表达，发挥NEC肠道保护作用，为NEC的预防和治疗提供了新思路。但本研究仅从动物水平探讨柚皮素对NEC的影响，并且无药物阳性组，无法评估柚皮素对NEC的影响程度。后期将进一步完善研究的局限性，并深入探讨柚皮素调控NLRP3炎性小体表达的可能分子机制。