人参皂苷Rh4调控ERK和AKT信号通路对T-ALL细胞凋亡的影响

王雪莲 孟亚红 孙丽华（上海复旦大学附属中山医院青浦分院血液科，上海201700）

T急性淋巴细胞白血病（T-acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一种侵袭性血液肿瘤，约占所有淋巴细胞白血病的20%，成人发病率显著高于儿童［1］。PI3K/AKT及ERK通路上调是T-ALL发生发展的重要通路，抑制其上调可治疗T-ALL［2-3］。人参作为传统中草药已被广泛使用2 000余年，具有抗过敏、抗氧化、免疫刺激等特性，可调节血压、代谢和免疫功能，人参皂苷Rh4是人参三醇的主要活性单体，仅结合1个糖基，具有低极性、易被肠道吸收的特点，可通过调节ROS/JNK/p53通路诱导结直肠癌细胞凋亡［4］。Rh4还可诱导白血病K562细胞分化并抑制其增殖，但对T-ALL的作用和机制尚未阐明［5］。本研究主要探讨人参皂苷Rh4通过调控ERK和AKT信号通路对T-ALL细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人T-ALL细胞系Molt4（CRL-1582，美国ATCC公司）；RPMI1640培养基（C11875500BT，美国Gibco公司）；人参皂苷Rh4（PHL85741，美国Sigma公司）；PI3K抑制剂LY294002（S1105）和MEK抑制剂U0126（S1102，Selleck公司）；CCK-8试剂盒（B20185364，碧云天公司）；Annexin V-FITC/碘化丙锭（PI）试剂盒（2170822）、FACSCantoⅡ流式细胞仪（加拿大BDBiosciences公司）；Model 680酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组和处理 Molt4细胞培养于RPMI1640培养基，加入终浓度为0、10、20、40、60、80和100μmol/L的Rh4培养24、48和72 h，CCK-8法计算抑制率=（OD实验-OD对照）/OD对照×100%。为研究Rh4通过PI3K/AKT通路对T-ALL的作用，将细胞分为对照组、Rh4组、Rh4+LY294002组和LY294002组，Rh4浓度为42.75μmol/L，LY294002浓度为50μmol/L［5-6］。为分析Rh4通过MEK/ERK通路对T-ALL的作用，将细胞分为对照组、Rh4组Rh4+U0126组和U0126组，Rh4浓度为40μmol/L，U0126浓度为50μmol/L［7］。对照组加入等体积溶剂培养48 h。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖情况 将1×105个处理后细胞（150μl）接种于96孔板，分别在第24 h、48 h和72 h加入10μl CCK-8试剂，37℃孵育显色，酶标仪检测450 nm处吸光度。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 处理后的细胞采用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，将1×106个细胞先后采用预冷PBS和5%牛血清白蛋白（BSA）洗涤3次，2 000 r/min离心，加入300μl 5%BSA和700μl 70%预冷酒精，低温孵育过夜，2 000 r/min离心5 min，PBS洗涤，加入100μl结合缓冲液和5μl Annexin-V-FITC（20μg/ml）静置15 min，黑暗中孵化，加入150μl结合缓冲液和10μl PI（50μg/ml）静置15 min，黑暗中孵化，流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达 将细胞研磨、裂解并收集总蛋白，分别取等量总蛋白在120 V下SDS-PAGE电泳分离90 min，50 V、120 min下转移至PVDF膜，封闭，分别加入anti-p-AKT、anti-AKT、anti-p-ERK1/2和anti-ERK1/2（1∶500）4℃孵育过夜，加入HRP偶联二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL曝光，以GAPDH为内参，Image PD软件定量。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，进行单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rh4对Molt4细胞的抑制作用 人参皂苷Rh4终浓度为0、10、20、40、60、80和100μmol/L时，抑制率分别为（0.00±0.00）%、（19.37±2.58）%、（32.58±3.67）%、（48.27±4.25）%、（63.85±5.92）%、（72.88±7.13）%、（80.51±8.68）%，提示人参皂苷Rh4可剂量依赖性抑制Molt4细胞，IC50为42.75μmol/L，因此，采用42.75μmol/L人参皂苷Rh4进行后续实验。

2.2 人参皂苷Rh4通过AKT通路对Molt4细胞增殖的影响 第48、72 h，Rh4组细胞增殖率显著低于对照组（P＜0.05），Rh4+LY294002组和LY294002组细胞增殖率显著低于Rh4组（P＜0.05），但Rh4+LY294002组和LY294002组差异无统计学意义（P＞0.05）。抑制PI3K/AKT后，人参皂苷Rh4抗增殖作用不显著，提示人参皂苷Rh4可能通过抑制PI3K/AKT通路抑制Molt4细胞增殖，见表1。

表1 人参皂苷Rh4通过AKT通路对Molt4细胞增殖的影响（±s）Tab.1 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through AKT pathway（±s）

表1 人参皂苷Rh4通过AKT通路对Molt4细胞增殖的影响（±s）Tab.1 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through AKT pathway（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Rh4 group，2）P＜0.05.

Groups Control Rh4 Rh4+LY294002 LY294002 24 h 0.47±0.04 0.41±0.03 0.37±0.03 0.39±0.03 48 h 0.72±0.08 0.58±0.061）0.48±0.06 1）2）0.50±0.05 1）2）72 h 1.19±0.12 0.73±0.081）0.59±0.06 1）2）0.62±0.06 1）2）

2.3 人参皂苷Rh4通过AKT通路对Molt4细胞凋亡的影响 与对照组［（3.52±0.79）%］相比，Rh4组细胞凋亡率［（11.89±1.68）%］显著升高（P＜0.05）。Rh4+LY294002组［（23.36±2.18）%］和LY294002组［（20.31±3.45）%］细胞凋亡率均显著高于Rh4组（P＜0.05），但Rh4+LY294002组和LY294002组凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。采用LY294002抑制PI3K/AKT通路后，Rh4对Molt4细胞的凋亡促进作用减弱，提示人参皂苷Rh4通过AKT通路促进Molt4细胞凋亡，见图1。

图1 流式细胞术检测人参皂苷Rh4通过AKT通路对Molt4细胞凋亡的影响Fig.1 Flow cytometry to detect effect of ginsenoside Rh4 on apoptosis of Molt4 cells through AKT pathway

2.4 各组细胞AKT通路磷酸化水平比较 Rh4组细胞p-AKT/AKT水平（0.82±0.08）显著低于对照组（1.62±0.13）（P＜0.05），Rh4+LY294002组（0.18±0.02）和LY294002组（0.22±0.02）细胞p-AKT/AKT水平显著低于Rh4组（P＜0.05），Rh4+LY294002组和LY294002组差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2 Western blot检测人参皂苷Rh4对AKT通路磷酸化水平的影响Fig.2 Western blot to detect effect of ginsenoside Rh4 on phosphorylation level of AKT pathway

2.5 人参皂苷Rh4通过ERK通路对Molt4细胞增殖的影响 第48、72 h，Rh4组细胞增殖率显著低于对照组（P＜0.05），Rh4+U0126组和U0126组细胞增殖率显著低于Rh4组（P＜0.05），Rh4+U0126组和U0126组差异无统计学意义（P＞0.05）。采用U0126抑制MEK/ERK通路后，人参皂苷Rh4抗增殖作用减弱，提示人参皂苷Rh4可能通过抑制MEK/ERK通路抑制Molt4细胞增殖，见表2。

表2 人参皂苷Rh4通过ERK通路对Molt4细胞增殖的影响（±s）Tab.2 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through ERK pathway（±s）

表2 人参皂苷Rh4通过ERK通路对Molt4细胞增殖的影响（±s）Tab.2 Effect of ginsenoside Rh4 on proliferation of Molt4 cells through ERK pathway（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Rh4 group，2）P＜0.05.

Groups Control Rh4 Rh4+U0126 U0126 24 h 0.51±0.05 0.43±0.04 0.38±0.04 0.40±0.05 48 h 0.76±0.07 0.61±0.071）0.49±0.071）2）0.53±0.061）2）72 h 1.22±0.13 0.76±0.091）0.61±0.081）2）0.65±0.071）2）

2.6 人参皂苷Rh4通过ERK通路对Molt4细胞凋亡的影响 Rh4组细胞凋亡率［（12.24±1.77）%］显著高于对照组［（3.61±0.86）%］（P＜0.05）。Rh4+U0126组［（18.74±2.64）%］和U0126组细胞凋亡率［（17.28±2.57）%］均显著高于Rh4组（P＜0.05），但两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。采用U0126抑制MEK/ERK通路后，Rh4的促细胞凋亡作用减弱，提示人参皂苷Rh4通过ERK通路促进Molt4细胞凋亡，见图3。

图3 流式细胞术检测人参皂苷Rh4通过ERK通路对Molt4细胞凋亡的影响Fig.3 Flow cytometry to detect effect of ginsenoside Rh4 on apoptosis of Molt4 cells through ERK pathway

2.7 各组细胞ERK通路磷酸化水平比较 如图4所示，Rh4组细胞p-ERK/ERK水平（0.81±0.09）显著低于对照组（1.17±0.12）（P＜0.05），Rh4+U0126组（0.23±0.03）和U0126组（0.30±0.04）细 胞p-ERK/ERK水平显著低于Rh4组（P＜0.05），两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 Western blot检测人参皂苷Rh4对ERK磷酸化水平的影响Fig.4 Western blot to detect effect of ginsenoside Rh4 on phosphorylation level of ERK

3 讨论

从分子水平上来说，T-ALL是一种异质性疾病，遗传损伤和微环境因素是引起T-ALL的主要原因。T-ALL是由不成熟的T细胞前体细胞恶性转化和克隆扩增引起的，成人T-ALL患者占所有T-ALL患者的25%，强化化疗方案治疗有效率为60%～80%，但多数患者出现复发和耐药，预后较差［8］。

中药抗肿瘤作用已受到广泛关注，研究中药活性单体化合物的抗肿瘤作用和机制可更好地发挥中药的抗肿瘤作用。人参的生物活性成分已被明确定义，包括人参皂苷、多糖、酚类、类黄酮和聚乙炔等，人参皂苷是根据薄层色谱中的保留因子值命名的，包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、Rs3、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg4、Rh4和Rh5等，具有神经保护、抗氧化、血管生成调节和细胞毒活性作用［9］。研究显示，人参皂苷Rh2可诱导白血病细胞凋亡，Rh4具有抗乳腺癌、食道癌等作用［10-12］。本研究初步研究了人参皂苷Rh4对T-ALL的作用，结果显示人参皂苷Rh4可剂量依赖性地抑制人T-ALL细胞系Molt4的生长，在42.75μmol/L时抑制率约为50%。

为进一步分析人参皂苷Rh4抑制T-ALL的机制，课题组分别采用LY294002和U0126抑制PI3K和MEK激酶，从而抑制其下游AKT和ERK蛋白磷酸化激活，抑制AKT和ERK通路。在T-ALL的恶性进展和耐药过程中，AKT和ERK通路均发挥促进作用［13-14］。研究显示在其他肿瘤中，人参皂苷可抑制AKT及ERK磷酸化［15-16］。本研究通过体外研究证实了人参皂苷Rh4可抑制人T-ALL细胞系Molt4增殖并促进其凋亡，LY294002和U0126可显著抑制Molt4细胞增殖和促进其凋亡，但在LY294002和U0126基础上，人参皂苷Rh4对Molt4细胞的增殖抑制和促凋亡作用并不显著。ZHONG等［17］研究显示，人参皂苷Rg1可通过调控FGF2-AKT信号轴缓解衰老小鼠认知缺陷。也有研究显示人参皂苷可通过抑制ERK调节炎症反应缓解硫代乙酰胺诱导的小鼠肝纤维化［18］。提示人参皂苷Rh4可通过抑制AKT和ERK相关通路发挥抗T-ALL作用。

综上所述，人参皂苷Rh4可通过抑制AKT和ERK通路抑制T-ALL细胞系Molt4增殖并促进其凋亡，人参皂苷Rh4的抗T-ALL作用和机制仍需进一步体内实验研究。