夷陵山羊微卫星标记杂合度与生长性状的回归关系

邓云霏，付玉蓉，沈洪学，刘桂琼，朱德江，张 敏,，姜勋平*

(1. 华中农业大学动物科技学院，湖北 武汉 430070;2. 宜昌市畜牧兽医中心，湖北 宜昌 443000; 3. 宜昌市畜牧技术推广站，湖北 宜昌 443000)

【研究意义】杂合度-适合度相关现象(Heterozygosity-fitness correlations，HFCs)在许多物种中已有发现，这些性状包括体重、存活率和发育稳定性等性状。多数研究发现个体杂合度与生长性状呈显著正相关[1-6]。近交和遗传漂变会降低遗传杂合度，低杂合度会降低适应性，从而导致杂合度与适合度相关[7]。杂合度可能是通过个体发育和生命早期最重要的环境之间的相互作用，即可能的生存能力选择对动物产生影响[8]。局部效应假设和一般效应假设认为，杂合度-适合度的相关性来自联合超显性，即受中性选择的微卫星标记与选择位点之间的遗传关联产生的表观杂合子优势[9]。【前人研究进展】个体多位点杂合度(Multilocus heterozygosity，MLH)是杂合子位点占所有测定位点的比值，其值越高说明近期系谱中的近交程度越低。Coulson等[1]假设微卫星标记的突变主要通过重复单位数量的逐步变化而发生变异，并据此提出用个体2个等位基因之间重复单位的平方距离(meand2，MD)作为衡量近交程度的指标。该方法基于逐步突变过程，适用于微卫星遗传标记[10]。MD是由单个个体在一个基因座上的2个等位基因计算的，是对形成个体的配子之间遗传距离的度量。MD记录纯合性，但对于拥有数个等位基因的微卫星，等位基因长度变异的贡献可能掩盖了纯合性的贡献。因此，MD一般包含比个体杂合度更深层和久远的遗传事件。MD是衡量近交程度的有用指标，在衡量近期育种模式的结果时，它与更遥远的事件有关[6]。MLH反映近期事件造成的个体遗传变异，MD反映远期事件造成的个体遗传变异。【本研究切入点】夷陵山羊是地方肉用山羊品种，分布在中国的三峡地区(TGA)。三峡地区众多的河流与沟壑划分出一系列相互独立的区域，在这里逐渐形成丰富的山羊品种资源。杂种优势在现代畜牧生产中受到广泛应用，杂合度-适合度的相关性研究在动物生产中具有重要价值。若在群体中存在正回归关系，则应采用育种方法提高个体杂合度。【拟解决的关键问题】确定夷陵山羊MLH、MD与生长性状、体重-体长指数之间的关系；比较MLH与MD2种指标在衡量近交程度上的差异，探索夷陵山羊体重是受近期还是远期变异的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采集5个三峡地方品种共269只山羊的血液样品，包括夷陵山羊(YL，n=37)、宜昌白山羊(YW，n=52)、麻城黑山羊(MB，n=60)、酉州乌羊(YB，n=60)和乌骨山羊(BB，n=60)，提取基因组DNA用于SNP测序，分析夷陵山羊与其他4种山羊的遗传分化。5个山羊品种主产区均分布于长江三峡地区沿岸。

采集247只夷陵山羊的血液样品，均为2岁及2岁以上的成年母羊，提取基因组DNA用于微卫星测序，分析微卫星杂合度与生长性状的关系。样本分别来自长阳永兴生态牧业科技有限公司(n=63)、宜昌老高荒生态农业有限公司(n=114)和秭归县两河口镇宋春雷山羊养殖家庭农场(n=70)，以上3个核心保种场饲养管理方式与营养水平一致。测定每只羊的体长、体高、胸围和体重，体重体尺测定参照农业部标准《绵、山羊生产性能测定技术规范》(NY/T 1236-2017)中的方法测定。

1.2 SNP测序分型

根据标准苯酚-氯仿法提取基因组DNA，溶解于TE缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)]中，并于-20 ℃储存。选择来自山羊的7条染色体的14个SNP标记，每个基因座的引物和基因分型方法如表1所示。

表1 14个SNP位点的引物序列、退火温度及基因分型方法

续表1 Continued table 1

1.3 微卫星测序分型

从GenBank和FAO公布的数据以及前人研究中[11]，挑选7个山羊通用微卫星位点。用荧光标记引物对各位点进行PCR扩增，毛细管电泳法进行测序分型(昆泰锐公司进行)。PCR扩增条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，退火20 s，72 ℃延伸10 s，从变性到延伸共进行35次循环。微卫星位点信息、退火温度如表2所示，PCR反应体系如表3所示。

表2 7个微卫星位点的引物序列和退火温度

表3 7个微卫星位点的PCR反应体系

1.4 数据分析

1.4.1 体重-体长指数计算 计算3种体重-体长指数：G指数(Gindex，IG)、体质指数(Body massindex，IBM)和体重指数(Ponderal index，IP)。

IG计算公式[12]：

IG=BW/BL1.5

(1)

式中，BW为体重，BL为体长。

IBM计算公式[13]：

IBM=BW/BL2

(2)

式中，BW为体重，BL为体长。

IP计算公式[14]：

IP=BW/BL3

(3)

式中，BW为体重，BL为体长。IP参考人类新生儿的体重-身高指数。

1.4.2 个体杂合度计算 用Excel计算个体的多位点杂合度(MLH)和等位基因距离平方均值(MD)。

个体多位点杂合度指n个位点上杂合位点数占总位点数的比值，计算公式如下：

MLH=Hi/n

(4)

式中，Hi是杂合位点数，n是所有位点数。

等位基因距离平方均值指个体n个位点上等位基因大小之差的平方和平均值，计算公式[1]如下：

(5)

式中，ia和ib是位点i上等位基因a和b重复单位的长度，n为个体计分的位点总数。

1.4.3 群体遗传参数分析 用Genepop计算5个山羊品种之间的Nei氏遗传距离，并用Mega v.10.0.5的Neighbor-Joining方法构建系统发生树。用POPGENE计算7个微卫星位点的群体观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)，用PIC_CALC计算多态信息含量(PIC)。

用SAS v9.4的GLM过程对MLH、MD与性状、体重-体长指数进行回归分析。为了提高正态性，对MD取对数值[lg(d2+1)][15]，并以该值进行后续分析。为了避免生长性状与杂合度两者间度量尺度差异过大导致的统计效力下降，对体长、体高、胸围和体重取对数值。该过程不会改变数据间的性质与相关关系，通过取对数压缩了变量尺度，以达到提高统计效力的目的。

2 结果与分析

2.1 品种间的亲缘关系聚类

根据Nei氏遗传距离，用Neighbor-Joining方法构建5个山羊品种的系统发生树(图1)。夷陵山羊和宜昌白山羊先聚为一类，再与酉州乌羊聚为一类，乌骨山羊和麻城黑山羊则单独聚为一类。

2.2 夷陵山羊体重体尺及其指数多样性

夷陵山羊成年体重变异范围较大(表4)，大于1倍标准差的比例是15.8%，大于2倍标准差的比例是1.2%。体尺、体重-体长指数也表现出相似的特点，表明该群体包含丰富的遗传变异。

表4 夷陵山羊体重、体尺及其指数的平均数、标准差和变异范围

2.3 夷陵山羊群体遗传标记多样性

夷陵山羊7个微卫星位点的平均等位基因数为8.6(表5)，等位基因座数量变异范围是6～10。夷陵山羊均显示出杂合性，7个位点的杂合度平均值为0.631，变异范围为0.360～0.837。期望杂合度平均值为0.672，变异范围为0.546～0.759。

7个位点的多态信息含量均值为0.615，除位点INRABERN172的PIC值为0.441，其余位点的均大于0.5，表明具有较丰富的遗传变异信息(表5)。

表5 夷陵山羊7个微卫星位点的杂合度和多态信息含量

2.4 夷陵山羊的MLH、MD与生长性状、体重-体长指数的回归关系

夷陵山羊4个生长性状与3个体重-体长指数中，体重与MD存在显著的回归关系(P<0.05，表6和图2)，回归方程表示为lg(WT)=0.03354lg(d2+1) + 1.403，MD可解释1.72%的体重变异。IG、IBM和IP分别与MD存在显著的回归关系(P<0.05)，回归方程分别表示为IG=8.32lg(d2+1) + 54.87，IBM=12.58lg(d2+1) + 70.83和IP=27.25lg(d2+1) + 120.4，MD可解释2.88%的IG变异，2.75%的IBM变异和2.34%的IP变异夷陵山羊MLH、MD与生长性状和体重-体长指数的回归曲线拟合度均较低(R2<0.1)。在其他物种的相关研究中，体重与杂合度回归曲线的拟合度均低于0.1(R2<0.1)[6]，说明在微卫星杂合度与适应性性状相关性研究中其拟合度较低属于普遍现象，与数据的对数转换无关。

表6 夷陵山羊MLH、MD与生长性状和体重-体长指数的单因素回归分析结果

3 讨 论

3.1 夷陵山羊与相邻4种山羊的遗传差异

夷陵山羊与其余4种山羊存在遗传差异。首先，夷陵山羊与宜昌白山羊先聚为一类。夷陵山羊主产区位于湖北宜昌，含有50%宜昌白山羊血缘、25%波尔山羊血缘和25%努比山羊血缘，此结果符合夷陵山羊的培育历史。其次，与夷陵山羊遗传距离较近的是酉州乌羊，最远的是麻城山羊和乌骨山羊。聚类结果与各山羊品种主产区的地理分布情况基本相符，这与三峡地区特殊的地理环境有关[16]。地理隔离是群体间基因交流的天然屏障[17]，尽管5种山羊的产地集中，地理距离相对较小，但三峡地区河流与沟壑众多，将此处的山羊群体划分至破碎的小生境中，加上各地交通不便，各个山羊群体之间几乎没有基因交流。上述条件使得分布在此处的山羊小群体产生分化，逐渐形成丰富的地方山羊品种。因此，夷陵山羊是独立于其他4种山羊的品种。

3.2 夷陵山羊体重与MD的关系

夷陵山羊体重与用微卫星标记估测的MD间有显著回归关系(P<0.05)，而体长、体高和胸围与MD没有显著回归关系(P>0.05)。在马鹿、斑海豹中发现初生重与MD之间存在正回归关系(P<0.05)[1, 18]。

Han等[19]在通山乌骨山羊中观测到体重、体长、体高、胸围和管围等性状与MLH具有显著回归关系(R2=2.51%～3.68%,P<0.05)。在鼠[2]、猪[3-4]、欧洲鳗鲡[5]和鸡[6]等物种中，也观测到杂合度与体重、生长速率等适应性性状存在正回归关系。由此可知，个体杂合度与体重等性状具有普遍的回归关系。但在本研究中，夷陵山羊体重与MLH间没有显著回归关系(P>0.05)。MLH与MD是衡量个体遗传多样性的两种不同指标，有关2种指标的相互补充与区别需进一步探讨。

3.3 夷陵山羊体重-体长指数与MD的关系

夷陵山羊IG、IBM、IP与MD间有显著回归关系(P<0.05)。未见其他MD与体重-体长指数关系的相关研究报道。

IG是由Gootwine[11]提出的一个新的体重-体长指数，专为绵羊而设计。IBM的含义是单位体表面积的平均体重。IBM是衡量动物机体能量储备的一个良好指标[20-23]。IBM包含体重和体型信息，与背膘厚、背最长肌和产奶量等营养状况性状的正相关表明IBM具有附加属性[24]。IP的含义是单位体积的平均体重，相当于机体密度的度量。目前在山羊上还未见关于IG、IBM、IP与MD之间关系的研究。实际上IG、IBM与IP都包含有体重和体型信息，它们与MD的正相关也说明杂合度高的个体在机体能量储备方面比杂合度低的更具优势。

3.4 夷陵山羊MLH与MD结果之间的对比

MLH与MD是有效衡量近交程度的指标，MLH反映近期事件造成的个体遗传变异，MD反映远期事件造成的个体遗传变异。

夷陵山羊的体重与MD间有显著回归关系(P<0.05)，但没有发现与MLH相关性(P>0.05)。MLH是杂合子位点占所有测定位点的比例，MD是形成个体的配子之间遗传距离的度量，MD相比MLH包含更多的种群历史信息。尽管有研究认为MLH比MD更适合作为杂合度-适合度相关性研究的遗传指标，但当种群存在群体统计学历史，或种群中所有个体都高度杂合时，同时使用这2种指标可能对进化过程的深入分析有所帮助，因此更传统的杂合度测量方法无法区分个体间差异[25]。Coltman等[18]认为，对于微卫星标记数据，MD比MLH更适用于衡量自然群体中的个体遗传变异。夷陵山羊是人工培育品种，其父系血统来自波尔山羊与努比山羊，母系血统来源于宜昌白山羊。波尔山羊是人工培育品种，努比山羊是从国外引进后经过本土化的人工培育品种，宜昌白山羊是经过长期选育的本土品种。夷陵山羊具有50%的宜昌白山羊血统。因此，本研究结果显示夷陵山羊的体重与MD的关系可能遗传于其母系品种宜昌白山羊的长期自然与人工选择事件的结果。

在本研究中，夷陵山羊的IG、IBM、IP与MD间有显著回归关系(P<0.05)，但与MLH没有相关性(P>0.05)。Gibbs与Chiucchi[26]对14个响尾蛇群体的研究表明，在13个群体中个体体质(以Scaled mass index衡量)与MLH没有相关性，仅有1个群体结果显著。IBM和IP是反映体型的体况指标。本研究的结果提示夷陵山羊的体型的个体间差异可能并非由近期发生的近交产生，而是由远期遗传变异事件造成基因组层面上的变异产生的，这可能要追溯到夷陵山羊品种形成之前的时期，即群体遗传分化。营养储备能力影响动物生存能力，由于IG、IBM与IP能在一定程度上反映营养储备能力，在适宜范围内，其值越大，个体具有更高的适应能力。IG、IBM和IP在衡量家养群体的个体遗传变异时具有各自的优点，在评估近交程度时可相互补充。

4 结 论

夷陵山羊的体重与MD之间存在显著的正回归关系，说明其体重变异可能是遗传于其母系品种宜昌白山羊的长期适应性进化的结果。夷陵山羊的IG、IBM、IP与MD之间存在显著的回归关系，即体型在一定程度上受远期遗传变异事件的影响。

致 谢：感谢宜昌市畜牧兽医中心与华中农业大学肉羊繁育课题组的刘辰晖、种玉晴、许锋等人在采样时给予的帮助。感谢长阳永兴生态牧业科技有限公司、宜昌老高荒生态农业有限公司和秭归县两河口镇宋春雷山羊养殖家庭农场工作人员的支持。