基于高通量测序的草莓白粉病病原菌分析

张振荣，田云霞，董琼娥，谭海燕，张丽芳，冯德党，赖泳红，杨俊誉，苏代发，崔晓龙*，童江云*

(1.昆明市农业科学研究院，云南 昆明 650034；2.云南大学生命科学学院/云南省微生物研究所，云南 昆明 650091)

【研究意义】草莓白粉病严重影响草莓产业的发展，造成极大的生产和经济损失[1]，为了研究草莓白粉病病原菌种类和寄生特性，通过高通量测序技术，分析白粉病病原菌种类，研究不同时期病原菌种类的变化，刚离体和离体一段时间后感病组织的微生物群落变化，分析草莓白粉病病原菌多样性情况，了解病害发生特点，对防治草莓白粉病有参考价值。【前人研究进展】目前，草莓白粉病病原菌的人工分离纯培养还没有实现，对草莓白粉病病原菌的鉴定主要依靠病原菌分生孢子、子囊果、附属丝等显微形态的观察[2]，鲜有用高通量测序技术或ITS基因测序鉴定草莓白粉病病原菌的报道。【本研究切入点】利用Illumina MiSeq高通量测序平台，对云南省昆明市3个主要栽培种冬草莓的白粉病病原菌进行真菌多样性分析，并将离体白粉病样品在灭菌培养皿内培养7 d，检测长出的真菌群落组成，对比病原菌群落变化，了解病原菌离体后的寄生特性。【拟解决的关键问题】明确昆明地区草莓白粉病病原菌种类和寄生特性，为进一步研究草莓白粉病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

实验所用DNA 抽提试剂盒(FastDNA®Spin kit for Soil)从MP Biomedicals生物医学公司处购买；GeneJET 胶回收试剂盒从Thermofisher公司处购买。由上海美吉生物医药科技有限公司提供MiSeq PE 300 高通量测序系统并进行测序和相关操作。

1.2 样品采集

于2019年2-4月在云南省昆明市西山区碧鸡镇观音山草莓种植区(该区域常年种植冬草莓100 hm2左右)，选取草莓白粉病爆发比较严重的3个地点，编号为地点1、地点2、地点3。每个地点的草莓面积不低于300 m2，3个地点的草莓发病情况和取样编号如下。

地点1的采样时间是2019年2月12日，草莓品种为章姬，大棚内地面土壤栽培，采样时白粉病主要集中在果上，草莓植株矮小，果实小，略微干瘪，白粉粉层明显，之前用过露娜森农药，大棚内高温干燥，土壤缺水明显。该地点的叶片白粉病样品编号为ZY1，果实白粉病样品编号为ZG1。

地点2的采样时间是2019年4月29日，草莓品种为章姬，大棚内地面土壤栽培，采样时白粉病主要集中在果实和叶片上，叶片上新叶发病最多，新叶背面白粉粉层比正面多，草莓生长状况比较好，最近一段时间用过土壤微生物复合菌剂。该地点的叶片白粉病样品编号为ZY2，果实白粉病样品编号为ZG2。

地点3的采样时间是2019年4月29日，草莓品种是红颜和桃香，大棚内采用基质槽基质栽培，其中红颜草莓的白粉病主要集中在老叶背面上，果实上有少量白粉，取红颜感病老叶样品编号HY；桃香草莓的白粉病主要集中在老叶背面上，多有干赤病斑，果实上没有白粉，取桃香感病老叶样品编号TY。

进行白粉病病原菌检测的ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY共6组样品，每组样品包含6片以上随机感病叶片(果实)。样品经灭菌工具采集后，置于无菌采集袋中，迅速带回实验室，在无菌操作台上用无菌脱脂棉擦拭样品表面的白粉孢子于无菌离心管中，-80 ℃保存，送上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。

被擦拭过白粉孢子的原草莓样品用于以下实验，地点2章姬草莓的白粉病果实和叶片(编号ZH)、地点3的红颜草莓的白粉病果实和叶片(编号HL)，每个样品随机选取3片叶片和3个果实，在灭菌大号培养皿内加入无菌水5 mL，封口膜封口，放入人工气候箱中培养，温度25 ℃，光强1500 lx，光照时间12 h·d-1[3]，培养7 d，用无菌脱脂棉擦取表面真菌送上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina高通量测序。

1.3 不同草莓白粉病样品的DNA提取及PCR扩增

依照DNA抽提试剂盒说明书提取样品总DNA，DNA浓度和纯度通过NanoDrop 2000检测， DNA提取质量用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测；采用引物ITS3F (5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’)和ITS4R (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对真菌ITS2区进行PCR扩增[4]，PCR反应体系：5 × FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，正向与反向引物各 0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板 DNA 10 ng，补无菌去离子水至20 μL。PCR反应参数： 95 ℃变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min；PCR扩增由ABI GeneAmp®9700型PCR仪所完成。

1.4 Illumina高通量测序

PCR扩增产物使用2%琼脂糖凝胶进行回收，用QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)进行定量，最后用MiSeq PE 300进行测序，实验中的样品均由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。

1.5 数据处理

高通量测序的原始数据用Fastp 软件(version 0.19.6，https://github.com/OpenGene/fastp)进行质控，用Flash软件(version 1.2.11，https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml)拼接， 用Uparse软件(version 7.1，http://drive5.com/uparse/)在97%的相似度下对序列进行OTU聚类并去掉单序列及嵌合体，用RDP Classifier(version 2.11，http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，在70%阈值下利用Mothur 软件(version 1.30.2，https://www.mothur.org/wiki/Download_mothur)将OTU与Unite (version 7.2，https://unite.ut.ee/)真菌数据库进行比对[5-7]。通过样品的稀释曲线、物种组成、物种差异等评估不同样品的真菌群落结构及多样性；Coverage 指数通过计算各个样本文库的覆盖率反映样本测序的深度和合理性，数值越高表明样本中序列被检测出的概率越高，测序结果越可靠[8]。以上分析通过上海美吉生物医药科技有限公司云平台(www.majorbio.com)进行。

2 结果与分析

2.1 测序深度分析

原始序列经优化处理后，8组样品， ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY、ZH、HL获得有效序列分别为71198、37793、59732、54618、54832、30558、71697和74360条。

由图1可知，样品的稀释曲线已趋于饱和，即使增加测序数据深度也无法再找到更多的OTU，表明现有测序数据深度已合理，测序结果能全面和真实的反映所有样本中真菌群落的多样性[8]。

2.2 草莓白粉病病原菌种类

如图2所示，检测草莓白粉病病原菌的6个样品：ZY1、ZG1、ZY2、ZG2、HY、TY，白粉病病原菌多样性分析结果基本相同，即在属水平上群落组成分析均显示98.8%以上是叉丝单囊壳属Podosphaera。

2.3 离体培养后的两个白粉病样品群落组成分析

离体白粉病样品在灭菌培养皿内培养7 d后，HL(地点3的红颜果实和叶片)样品上长出许多浅绿色的粉状霉菌，群落组成分析显示真菌菌属为青霉属Penicillium(88.80%)、Cladosporium(9.38%)、Acremonium(1.44%)、others(0.25%)；ZH(地点2的章姬果实和叶片)样品上长出许多黑色粉层的霉菌，群落组成分析显示真菌为曲霉属Aspergillus(86.87%)、

2.4 白粉病原菌不同样品的真菌菌落比较分析

由表1和图4可以看出，刚离体的6个白粉病样品结果非常接近，物种组成非常相似，但与离体7 d后的2个样品(HL和ZH)真菌群落组成存在显著差异。

表1 ZY1、ZY2、ZG1、ZG2、HY、TY、HL、ZH样品真菌群落组成(相对丰度)

3 讨 论

实验显示，2019年2-4月昆明地区3个冬草莓栽培种章姬、红颜、桃香的白粉病病原菌均为叉丝单囊壳属Podosphaera，不同草莓品种和感染部位的白粉病病原菌相同，这是首次报道中国西南地区草莓白粉病病原菌种类。因草莓白粉病病原菌属于专性寄生菌，目前还没有实现人工离体纯培养[1]，所以暂时无法用基因测序技术鉴定到种。草莓白粉病病原菌为叉丝单囊壳属Podosphaera，这个结果与王佩玲等[3]在2017年用显微镜观察陕西杨凌‘早红’草莓品种鉴定草莓白粉病病原菌为子囊菌门核菌纲白粉菌目叉丝单囊壳属的报道相同。但也有报道显示了不同的研究结果，Pei 等[9]于2017 年首次报道，2014年4月河南商丘地区60%草莓爆发白粉病，利用ITS1/ITS4扩增rDNA并测序，结合形态观察鉴定当地草莓白粉病的病原菌为Golovinomycesorontii；关玲等[10]将草莓白粉病的病原表述为子囊菌亚门真菌(Sphaerothecamacularisf.sp.Fragariae)；刘博等[11]研究发现，草莓白粉菌为羽衣草单囊壳[Sphaerothecaaphanis(Wallr.)Braun]，属子囊菌亚门白粉菌目白粉菌科单囊壳属，经核对文献后发现有误，陈桂清等[12]并没有羽衣草单囊壳侵染草莓或草莓属植物，该研究叉丝单囊壳属Podosphaera的寄主植物有蔷薇科的苹果属、梨属、梅属、山楂属、绣线菊属、花楸属以及桦木科的桦木属植物上，也没有提及草莓属植物，说明引用将草莓白粉病病原菌表述为羽衣草单囊壳[Sphaerothecaaphanis(Wallr.)Braun]，是错误的。

草莓白粉病病原菌感病的部位离开母体植株后，感染部位表面很快生长出其他真菌菌落，新长出的菌以青霉属和曲霉属为主，而原白粉病原菌不再是优势菌群，说明草莓白粉病病原菌是活体营养寄生菌，即病原菌只能在活的植物上生长发育和繁殖，从活的植物组织中得到营养完成生活史，一旦离体后生长减弱甚至被其他菌完全覆盖，支持了白粉菌是活体营养寄生的观点。同时也说明，利用草莓叶片制作叶盘来进行离体感染和鉴定[13]的方法可能是不科学的。此外，感染白粉病的草莓植株，一般出现白粉层、叶片老化和萎蔫的症状，很长一段时间甚至整个生育期都不会死亡，可能与该病原菌的寄生特性有关，或许可以用陈相永等[14]提到的“死体营养型致病菌需要通过增强植物细胞壁的降解作用来实现广谱侵染，而活体营养型致病菌通过弱化植物细胞壁的降解能力来避免诱发寄主出现病征或死亡”加以解释。在侵染部位方面，白粉病原菌侵染章姬品种上多个部位，果实和叶片都有，而在红颜和桃香上，更喜欢侵染叶片，有可能跟这两个品种的果实化学成分不同有关，比如实验中发现，草莓果实口感偏甜时更容易感染白粉病，而口感偏酸的果实很少染白粉病。

4 结 论

2019年2-4月昆明地区冬草莓栽培种的白粉病病原菌为叉丝单囊壳属Podosphaera，不同草莓品种和感染部位的白粉病病原菌相同，是首次报道中国西南地区草莓白粉病病原菌种类。草莓白粉病病原菌感病的部位离开母体植株后，感染部位表面很快生长出其他真菌菌落，原白粉病原菌不再是优势菌群，说明草莓白粉病病原菌是活体营养寄生菌。该病原菌还表现出侵染周期长、侵染不同品种的不同组织的特性。