Dehydroheliobuphthalmin与 Lapatinib联合应用靶向抑制NCI-H441细胞的研究

罗 锐，赵 月，爨向丹，杨星莹，朱威巍，黄艳苹，王宣军*，盛 军

(1.云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室，云南 昆明 650201；2.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201; 3. 云南省高原特色农业产业研究院，云南 昆明 650201)

【研究意义】肺癌在全球恶性肿瘤中的发病率和死亡率均居首位[1]。肺癌是第2大常见癌症，绝大多数肺癌病例是非小细胞肺癌(NSCLC)[2]。非小细胞肺癌约占所有肺癌病例的85%，其中30%为鳞状细胞癌(SCC)，70%为腺癌和大细胞癌[3]。EGFR是一种酪氨酸激酶受体，参与细胞生长和存活[4]。人表皮生长因子受体(EGFR)含有一个胞外区、一个疏水性跨膜段、一个带有膜旁区段的胞内区和一个蛋白激酶活性区，激酶区是抗癌药物开发中探索最多的结构域之一[5]。EGFR参与影响细胞生长、分化和新陈代谢的磷酸化反应[6]。EGFR的激活始于其胞外区与内源性表皮生长因子的结合，促进了EGFR 4个成员间不对称同源和异源二聚体的形成[7]。EGFR的配体激活导致与其家族成员的同源和异源二聚化，这种二聚化导致EGFR磷酸化。EGFR在40%～80%的非小细胞肺癌和许多其他上皮性癌中过表达[8]。靶向EGFR的药物对于非小细胞肺癌的治疗具有重要意义。【前人研究进展】关于Dehydroheliobuphthalmin(Dehy)的研究仅有一篇文献报道，在侧柏叶90%的甲醇组分中分离出3种木脂素类化合物，其中Dehy在原代培养的大鼠皮层细胞中，对谷氨酸诱导的神经毒性具有显著的神经保护作用[9]。但是在白附子中发现一种木脂素抑制SGC-7901细胞增殖[10]。木脂素类化合物具有细胞毒作用，可以抑制肿瘤细胞的生长，并且某些木脂素类化合物能导致细胞周期阻滞，木脂素的抗肿瘤作用可能受周期阻滞及其细胞毒性的双重影响。目前抗肿瘤作用机制大体有如下几个，抑制细胞增殖，诱导分化；诱导细胞凋亡；抗血管生成；逆转肿瘤细胞耐药等，还有许多尚不确定的机制尚待研究。Lapatinib，一种口服酪氨酸激酶抑制剂，能有效抑制人类表皮生长因子受体-1(ErbB1)和人类表皮生长因子受体-2(ErbB2)酪氨酸激酶活性。研究中发现Lapatinib对EGFR和HER2的双重抑制效果未在非小细胞肺癌中表现出其更加显著的效果[11]。在三阴性乳腺癌中，Lapatinib通过抑制三磷酸腺苷(ATP)的结合和抑制磷酸化来抑制肿瘤细胞的增殖和存活[12]。虽然Lapatinib在乳腺癌中的治疗效果较好，但在野生型EGFR非小细胞肺癌中并未发现Lapatinib有治疗效果，但是其对EGFR过表达的细胞具有一定的抑制效果。【本研究切入点】本研究对比了Dehy联合应用Lapatinib对NCI-H441和NCI-H1975细胞的影响，从细胞存活率、克隆形成、细胞凋亡情况、细胞周期进展、细胞信号转导变化方面阐述了二者联合应用的作用机制。【拟解决的关键问题】验证木脂素类化合物与抑制剂联合应用是否具有协同抑制NCI-H441细胞存活的效果，以期为EGFR野生型非小细胞肺癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用的化合物Dehy，分子式C22H20O8，来源于植物侧柏，纯度99%，购于云南西力生物技术股份有限公司，其结构式如图1所示。实验用细胞NCI-H441和NCI-H1975购于美国典型培养物保藏中心(Manassas, VA, USA)，并在含10% FBS和1%P/S的DEME培养基中于37 ℃下在含5%CO2的潮湿培养箱中进行培养(BINDER; Tuttlingen, Germany)。实验用抗体购于Cell Signaling Technology公司。

1.2 试验设计

首先计算化合物Dehy的IC50值，确定Dehy对NCI-H441细胞的最大无显著性抑制的浓度，利用该浓度的Dehy和Laptinib分别处理NCI-H441细胞和NCI-H1975细胞；试验设4个处理组，对照组：con；Dehy组：Dehy；Lapatinib组：Lap；Dehy联合应用Lapatinib组：Dehy+Lap。并依次测定4个处理的2种细胞存活率、克隆形成；检测4个处理组的NCI-H441细胞中EGFR信号转导变化；检测4个处理的2种细胞凋亡水平和周期进展情况。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与传代 当细胞汇合度达到85%～90%时，在超净工作台中，吸去培养皿中培养液，无菌PBS清洗；培养皿中加入无菌的胰蛋白酶-EDTA(0.25%)1 mL，混匀，放置于恒温培养箱消化，吹打细胞将悬液移至离心管中，1500 r/min，离心3 min，吸去上清，加入培养基吹打均匀，将细胞悬液按照1∶5的比例，滴入100 mm培养皿，移至恒温培养箱中培养。

1.3.2 MTT检测细胞增殖 将细胞接种于96孔无菌培养板中，恒温培养箱中过夜；然后按照每孔200 μL的规格加入相应的配好的药，在恒温培养箱中培养48 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，避光4 h；4 h后，吸去每个孔的上清，每孔加入150 μLDMSO，在微孔板震荡仪上震荡使孔中的紫色沉淀完全溶解；将96孔板放于酶标仪中，在492 nm处读取细胞的吸光值。

1.3.3 集落形成实验 将1×105个NCI-H441细胞和NCI-H1975细胞接种到60 mm培养皿中，过夜，标记并加入相对应的药，隔2 d换1次新的培养基并重新加入相对应的药，连续培养14 d左右；14 d后，弃去培养液，用PBS洗2遍，然后每板加入3 mL甲醇固定15 min，弃去甲醇后，再用0.1%结晶紫溶液避光染色20 min，用静止的水缓慢洗去结晶紫，室温晾干后拍照；拍照后，加入5%的冰乙酸溶解细胞，溶解转移至96孔板中，于570 nm处读取吸光值，设3组平行实验。

1.3.4 细胞蛋白表达检测方法 吸光度测定：37 ℃恒温孵育30 min，将96孔板取出，转移至多通道酶标仪中，测定其吸光度。测定波长分别为560 nm和630 nm，测定数值均扣除空白孔吸光值，即得到样品吸光值。样品浓度的计算：将样品的吸光度代入公式，计算样品总蛋白浓度。化学显影：将A液和B液按1∶1配置，混匀；将膜与AB混合液充分接触；点击“Expose”开始曝光。曝光时间根据出现条带的曝光程度自动选择曝光停止时间，曝光停止后选择合适的图片拷贝。

1.4 数据分析与统计

采用SPSS 17.0软件进行显著性分析(mean+SEM，one-way ANOVA)，*P<0.05为差异有显著性，**P<0.01为差异有明显显著性，***P<0.001为差异极显著。使用GraphPad Prism5作图软件，对实验数据进行作图。细胞存活率=[(As-Ab)]/[(Ac-Ab)]×100%，As：实验孔吸光度；Ac：对照孔吸光度；Ab：空白孔吸光度。细胞抑制率=1-细胞存活率。IC50值计算方法：将浓度转换未log10，存活率更换为抑制率，利用Graphpad Prism5软件选择第一个散点图，数据录入表格，选择“Analyze”，在“XY analyses”中选择“Nonlinear regression”，选择“log(inhibitor) vs.response”。

2 结果与分析

2.1 Dehy对NCI-H441细胞存活率的影响

随浓度的增加NCI-H441细胞的存活率逐渐降低；试验发现10 μmol是当前的最大无效浓度(P>0.05，图2)，通过计算得出Dehy的IC50值为14.08 μmol(图3)，因此Dehy对细胞存活存在一定的抑制效应，试验浓度确定为10 μmol。

2.2 Dehy+Lap对NCI-H441和NCI-H1975细胞增殖率的影响

Dehy和Lap都分别抑制了NCI-H441细胞的存活率，Dehy +Lap组的NCI-H441细胞存活率要极显著低于Dehy组和Lap组(P<0.001，图4)。Lap组与对照组相比NCI-H1975细胞存活率无显著降低(P>0.05)，并且Dehy+Lap组与对照组(Con)相比NCI-H1975细胞的存活率也未受到显著抑制(P>0.05，图5)。

Dehy+Lap组对NCI-H441细胞的抑制率大于Dehy组和Lap组，由于Dehy+Lap仅对EGFR(wild-type)细胞具有抑制效应，而对EGFR(mutant)无抑制这一结果，试验猜测Dehy联用Lap是具有靶向性的。

2.3 Dehy与Lap联合应用对NCI-H441和NCI-H1975细胞集落形成的影响

Dehy+Lap组NCI-H441细胞的集落数量显著减少(图6)，并且Dehy+Lap组细胞存活率显著低于Dehy组和Lap组(P<0.001，图7)；在NCI-H1975细胞中，Dehy+Lap组和其它3组染色结果无明显变化(图6)，经SPSS分析也无显著性差异(P>0.05，图7)。

2.4 Dehy与 Lap联合应用对NCI-H441细胞EGFR信号通路的影响

Dehy+Lap组显著抑制NCI-H441细胞p-EGFR、p-JNK、p-JAK、p-Stat3、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平。这表明Dehy联用Lap抑制EGFR下游的2条信号通路相关蛋白的表达水平。

2.5 Dehy与 Lap联合应用对NCI-H441凋亡率的影响

Lap处理细胞后凋亡总数少于对照(Con)，Dehy+Lap处理后，细胞早期凋亡和晚期凋亡的数量都大于对照组(Con)、Dehy组和Lap组(P<0.001，图9)。这表明Dehy联用Lap具有增加NCI-H441细胞凋亡率的效果。

2.6 Dehy 与Lap联合应用对NCI-H441和NCI-H1975细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

由图10可知，与对照组(Con)、Dehy组和Lap组相比，Dehy+Lap组cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白表达水平显著增加；Bcl-2蛋白表达降低；Bax蛋白表达增加；cleaved-PARP蛋白表达增加。这表明Dehy联用Lap通过激活Bcl-2家族、Caspase家族相关蛋白，并通过PARP和Caspase-3来执行NCI-H441细胞的凋亡。Dehy+Lap处理NCI-H1975细胞24 h后，未能激活Bcl-2家族、Caspase家族相关蛋白。这表明在NCI-H1975细胞中Dehy联用Lap不能调节相关细胞凋亡蛋白水平。

2.7 Dehy与Lap联合应用对NCI-H441和NCI-H1975 细胞周期相关蛋白表达水平的影响

由图11可知，在NCI-H441细胞中Dehy+Lap组与对照组(Con)、Dehy和Lap组相比，其增加p21蛋白表达水平，因此抑制CDK2蛋白表达水平，进而抑制CyclinE蛋白表达水平；并且增加p27蛋白表达水平，因此抑制CDK4蛋白表达水平，进而抑制CyclinD蛋白表达水平；p53蛋白与细胞周期阻滞、DNA修复相关，在此次实验中Dehy联用Lap后NCI-H441细胞p53蛋白表达水平增加。这表明Dehy联用Lap能够阻碍NCI-H441细胞从S期至G2期。Dehy+Lap处理NCI-H1975细胞后，细胞周期蛋白(CyclinE、CyclinD)未受到抑制、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2、CDK4)未受到抑制，并且 (p21Waf1/Cip1、p27Kip1)蛋白表达也未增加。这表明在NCI-H1975细胞中Dehy联用Lap对细胞周期进展无明显影响。

3 讨 论

3.1 抑制剂对EGFR野生型非小细胞肺癌治疗效果差

表皮生长因子受体(EGFR)在多种肿瘤的增殖和转移中起关键作用。EGFR 40%～80%在NSCLC过表达[13]。当EGF等配体与EGFR结合之后，EGFR与ErbB家族其他成员发生同源或异源二聚化，导致其胞浆尾部特定酪氨酸残基的磷酸化，从而激活细胞下游信号通路，促进细胞增殖、分化、血管生成和运动[14]。酪氨酸激酶抑制剂在EGFR活性激酶结构域ATP结合位点结合，但由于其作用效率低，并会发生获得性耐药和点突变的原因，第一代酪氨酸激酶抑制剂不能完全的抑制EGFR(wild-type)活化，慢慢的(TKIs)成了EGFR野生型非小细胞肺癌患者二线或三线环境中的治疗选择。然而，其反应率很低，只有大约25%能达到疾病控制[15]。

3.2 EGFR野生型非小细胞肺癌治疗趋向于联用

目前EGFR(wild-type)的治疗趋向于联合治疗，且治疗方案较少。Jian-Shu Lou发现银杏黄酮和顺铂联合处理后，银杏黄酮诱导的铁下垂和顺铂诱导的细胞凋亡效应均被联合用药放大，对EGFR野生型非小细胞肺癌细胞毒作用增强[16]。Ke Li研究发现在A549细胞中，Quinalizarin抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，与Icotinib联用部分恢复了细胞对Icotinib的敏感性，联合使用CK2抑制剂(Quinalizarin)和伊考替尼比单独使用伊考替尼有更好的抗肿瘤活性[17]。YM155和厄洛替尼的联合应用,显著提高了Erlotinib对A549(EGFR野生型)的敏感性[18]。Taichi Takashina 等利用EZH2抑制剂3-deazaneplanocin A与HDAC抑制剂 (SAHA)联合处理抑制了H1299细胞和A549细胞EGFR信号转导，并且联合处理协同抑制了所有受试NSCLC细胞系的增殖[19]。EZH2抑制剂GSK343和DZNep联合吉非替尼能逆转H1299细胞和A549细胞对EGFR-TKIs的耐药性[20]。Jade H.-M. Hsu 发现Withaferin A与常规化疗药物联合治疗EGFR野生型肺癌患者[21]。Lecia V. Sequist 发现Seribantumab联合Erlotinib治疗EGFR野生型非小细胞肺癌患者的随机II期试验中，Seribantumab和Erlotinib的联用改善了患者PFS(无进展生存期)[22]。Chun-Hau Dai 研究发现Afatinib和雷公藤红素联合应用可有效抑制H23和H292细胞存活，其机制可能与诱导细胞凋亡有关[23]。

3.3 天然化合物的抗癌前景广阔，但缺乏机理验证

由于替代药物未能发现免疫抑制和癌症等关键治疗领域的新实体，人们对天然产物的研究重新产生了兴趣[24]。目前近63%的抗癌药物是天然产物，或者可以追溯到天然产物来源[25]。对于野生型非小细胞肺癌，利用Lap就可以沿着活化的EGFR下游蛋白寻找其作用靶点。结合Dehy这一天然产物具有多种生物活性，其抗癌作用已有部分研究成果，但都是单独用药，由于该类化合物的种类较多，其对细胞的作用机理尚不清楚。因此，笔者猜测Dehy可能存在类似EGFR配体的功能，其能结合到EGFR胞外结构域，进而减少EGFR的激活，因此当Dehy与Lap联合应用时，该组合具有协同效应。但由于此实验缺少动物实验的进一步验证，因此对Dehy是否与EGFR存在具体的结合位点还有待验证。

3.4 EGFR野生型非小细胞肺癌患者占比高

当前以EGFR(wild-type)的患者仍然占大多数。EGFR突变阳性患者的发病率在亚洲人群中约为30%，在西方国家中仅为10%～15%[26]。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的比率为85%，其中超过60%表达野生型EGFR[27]。以EGFR(wild-type)为焦点是研究新的治疗策略的开端，本研究利用天然化合物Dehy的抗癌活性为起点，联合应用第一代酪氨酸激酶抑制剂Lap，不仅提高了Lap 的利用率，还发现了联合用药后仅对EGFR(wild-type)细胞NCI-H441有抑制效应，而对NCI-H1975无效这一现象，并解释了其作用机制为：从细胞EGFR的信号转导开始，到最终作用细胞核中的关键蛋白，整个信号传递链上都发现Dehy+Lap的组合调节了重点的关键蛋白，最终影响细胞的增殖分化，这对靶向EGFR(wild-type)细胞NCI-H441的治疗方式的更新和作用机制具有重要意义。

4 结 论

经多种细胞实验证明，Dehy联用Lap抑制EGFR及下游相关蛋白磷酸化的表达水平，通过调节凋亡相关蛋白和增加细胞的凋亡率、调节周期相关蛋白导致细胞周期阻滞的方式最终抑制EGFR(wild-type)细胞NCI-H441的存活。本研究为野生型非小细胞肺癌临床应用提供了可能的新的治疗策略和新的研究方向。