吗啡暴露对猫行为敏化与神经元凋亡的影响

邱 刚，房保栓，李永杰，范诒忠，潘庆亚，张献波，郭 韬

(1. 河北省人民医院，河北 石家庄 050051；2. 清河县中心医院，河北 清河 054800)

吗啡是在19世纪初被科学家从阿片中提取的一种生物碱，是一种重要的阿片类药物[1]。目前临床上吗啡被广泛用于镇静、止痛，可以使患者产生强烈的欣快感，但是长期应用会出现精神异常、认知障碍、行为不受自主控制等异常，并且随着剂量的增加，最终导致成瘾。这种成瘾主要表现为精神和躯体依赖，精神依赖表现为对药物的渴求和觅药行为，躯体依赖表现为对药物的耐受和行为敏化。精神依赖是吗啡诱导的行为敏化的主要表现，吗啡成瘾最特征性的表现是行为敏化。行为敏化是指生物反复接受某种依赖性药物(如尼古丁、吗啡、酒精等)后，出现的自发性活动反应增强的现象[2]，在动物身上主要表现为自发性运动活性增加。有多种神经回路系统参与吗啡成瘾和行为敏化的过程，其中中脑-边缘多巴胺系统是所有成瘾类药物产生奖赏效应的神经结构基础，在把情绪转化为意向行为的过程中起重要作用[3]。本研究通过建立吗啡猫行为敏化模型，探讨了行为敏化与脑组织神经元凋亡的相关性，旨在为临床合理治疗药物成瘾提供行为学及病理学依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 成年健康雄性家猫12只，体重2～3 kg，由河北省人民医院实验中心提供，动物合格证号：SYXK(冀)2020-005，饲养条件为室温20～25 ℃，相对湿度55%～70%,动物在笼中饲养，自由摄食饮水，喂家猫颗粒料。

1.2实验药品 盐酸吗啡注射液，沈阳第一制药厂，国药准字H21022436，麻醉药品和精神药品生产定点批件号：TD2006-0028。

1.3实验方法 将12只猫随机分为对照组3只和实验组9只，参照文献[4]方法造模。①行为敏化诱导阶段(第1～5天)：实验组猫于每日8点、12点、16点皮下注射盐酸吗啡注射液，第1天2.5 mg/kg，第2天5 mg/kg，第3天7.5 mg/kg，第4天10 mg/kg，第5天12.5 mg/kg，连续5 d；对照组猫在同样的时间和部位注射等量的生理盐水。②行为敏化戒断阶段(第6～8天)；2组猫无任何处理3 d。③行为敏化检测阶段(第9天)：2组干预方法同行为敏化诱导阶段。

1.4检测指标及方法

1.4.1猫行为敏化检测 实验第9天，依照文献[2]中相关评定标准评定2组猫敏化行为，包括扭体、湿狗样抖、站立、跳跃、清理皮毛、齿颤、上睑下垂，其中上睑下垂每2 min评定1次，观察60 min，记录上述行为发生次数。

1.4.2脑组织病理学观察 在造模后的第3周对2组猫进行脑组织取材，制备电镜标本：用3%戊巴比妥以1 mL/kg的剂量对猫进行腹腔注射麻醉，剪开猫的胸前壁，暴露出心脏，用250 mL生理盐水灌入升主动脉，接着用含4%多聚甲醛的PBS液继续灌注，依次留取猫的额、颞、顶、枕叶组织。将脑组织切割为1 mm3左右小块，用2.5%戊二醛固定，制成超薄切片，JEM-1230(JEOL Electron Microscope，Japan)透射电镜下观察照相。

2 结 果

2.12组猫行为敏化情况比较 2组猫均无死亡。实验组猫的扭体、湿狗样抖、站立、跳跃、清理皮毛、齿颤、上睑下垂次数均明显高于对照组(P均<0.05)，实验组猫出现行为敏化现象，对照组猫无行为敏化。见表1。

表1 对照组和吗啡暴露实验组实验第9天猫行为敏化次数比较次)

2.22组猫脑组织电镜下病理表现

2.2.1实验组 猫皮质神经元大多呈凋亡状态，并且早、中、晚期均有凋亡的神经元。凋亡早期：细胞失水，神经细胞固缩，胞浆减少，细胞器浓缩，细胞核异染色质轻度浓缩、边集，电子密度高于正常；核仁消失，核膜尚完整；内质网肿胀、线粒体肿胀、空泡样变性，见图1。凋亡中期：细胞核异染色质进一步浓缩，均质无结构，电子密度进一步升高，并且出现尼氏体、线粒体溶解。凋亡晚期：核异染色质高度聚集、边集，核裂解形成碎片，碎片形态不一，电子密度有所下降，核膜不规则或出现核膜破裂，胞浆内可观察到被吞噬的凋亡小体。神经元轴突、树突及突触发生多种超微结构改变：胞突及线粒体肿胀，空泡化，胞突透亮，见图2；胞突微丝结构崩解，线粒体肿胀，内质网、高尔基体扩张，核电子密度增加，核周隙扩张，见图3；胞突电子密度明显升高；轴质结构紊乱，髓鞘脱层、断裂，见图4；部分脑皮质突触密集，可见大量的轴-轴突触、轴-树突触，突触小泡密集，见图5。中枢神经元变性坏死，具体表现为线粒体瘠消失，内质网扩张，细胞质内细胞器减少，细胞核周间隙变大，核膜模糊不清，染色质边集，见图6。额、颞、顶、枕叶部位的神经元病变类型及程度无明显差异。

图1 电镜下吗啡暴露实验组猫脑组织神经元凋亡及内质网扩张(×5k)

图2 电镜下吗啡暴露实验组猫脑组织神经元胞突及线粒体肿胀、空泡化(×10k)

图3 电镜下吗啡暴露实验组猫脑组织神经元线粒体肿胀，内质网、高尔基体扩张(×5k)

图4 电镜下吗啡暴露实验组猫脑组织神经元轴质结构紊乱，髓鞘脱层、断裂(×5k)

图5 电镜下吗啡暴露实验组猫脑组织神经元突触、突触小泡密集(×30k)

图6 电镜下吗啡暴露实验组猫脑组织神经元固缩，线粒体瘠消失，细胞质内细胞器减少，细胞核周间隙变大，核膜模糊不清(×5k)

2.2.2对照组 猫的脑组织神经元细胞核电子密度低，细胞质内细胞器形态正常，排列整齐，细胞核核膜清晰可见，染色质密度正常，见图7。

图7 电镜下对照组猫脑组织神经元细胞核、细胞质、细胞器结构完整，排列整齐(×6k)

3 讨 论

吗啡有许多药理作用，包括镇静、镇痛、催吐、抑制呼吸等，但吗啡被吸收入血后可以通过血脑屏障直接进入中枢神经系统，从而产生神经毒性，使神经细胞出现功能障碍或坏死，造成永久性功能损伤[5]。Robinson等[6-7]认为吗啡可以持久地改变脑神经环路，使神经环路对吗啡类药物的刺激持续超敏，从而使躯体产生对吗啡的依赖。吗啡成瘾患者出现行为敏化后，其所表现的神经及精神症状复杂多样。从行为学角度来看, 吗啡成瘾以及行为敏化的产生是一种特殊的恶性学习、记忆过程, 是一种畸形记忆[8]。突触可塑性的变化是正常记忆形成的结构基础，一旦突触的可塑性发生改变，就会形成畸形记忆，最终发展为对吗啡持续和顽固的依赖作用。 在本实验中，猫应用吗啡后出现行为敏化，是阿片类药物成瘾的特征性表现，与吸毒者应用毒品后的表现很相似，说明在动物实验中的发现可以在一定程度上解释吗啡对人体的毒性损害。

细胞凋亡是一种由基因控制，使细胞程序性死亡的现象。细胞凋亡维持着生物体自身内环境的稳定，对个体的生长发育和免疫调节具有重要的作用。Bajic等[8]发现，给予大鼠注射吗啡后，其大脑皮质与杏仁核出现神经元凋亡。Hassanzadeh等[9]和Shafie等[10]发现，在吗啡的作用下，抗凋亡因子Bcl-2水平下降，大脑神经元发生凋亡。封小强等[11]研究表明，吗啡能够损伤神经元中线粒体的超微结构，影响线粒体的正常功能，最终使整个细胞的能量代谢发生障碍，从而抑制脑的功能活性，是吗啡导致神经中枢出现功能障碍的始动因素。本实验中应用电镜观察猫的脑组织，发现吗啡暴露猫的神经细胞出现凋亡、变性、死亡，细胞核核膜模糊不清，染色质边集等，中枢神经元大部分呈凋亡状态，主要以尼氏体溶解、水样变性为主；神经元细胞器各组分的多种超微结构也发生改变，如内质网肿胀扩张、线粒体肿胀、粗面内质网扩张等；神经元的轴突、树突也发生了病理性改变，在部分脑组织中突触小泡密集存在，可见较多的轴-轴突触、轴-树突触，这说明吗啡可能对大脑皮质的轴突、树突和突触数量产生影响。吗啡使中枢神经细胞凋亡、变性、坏死后，机体为了维持正常的生理功能，周围存留的细胞会发出侧支，形成新的突触，以维持躯体正常的神经功能[4]。神经元的突触不断丢失和重组，使神经细胞间的正常秩序受到破坏，这可能是吗啡诱导猫产生行为敏化的神经电生理学基础。另外吗啡可以作用于多处大脑功能区，包括纹状体和多巴胺能神经支配的靶点，如前额叶皮质、杏仁核、海马等，这些区域都属于吗啡成瘾脑内“奖赏环路”上的重要环节[12-13]。王建材等[14]发现吗啡可以使海马的树突棘消失，从而引起海马的损伤。Erbs等[15]发现吗啡可以减少海马区阿片受体细胞的密度并使其重新分布，使海马功能发生改变。这些区域的神经细胞凋亡必将严重影响离子通道开放、突触传递、受体结合等分子生物学过程，造成相关神经活动、行为运动、自身调节紊乱，最终导致行为敏化现象。说明神经元凋亡既是吗啡神经毒性直接作用的结果，也是行为敏化产生的病理解剖学基础。

综上所述，吗啡可导致多种脑组织病理损害，吗啡成瘾猫的行为敏化与脑神经元凋亡有密切关系。但吗啡成瘾不是单一的诱导机制，吗啡诱导行为敏化的机制是十分复杂的，涉及一系列微观调控系统的改变，深入研究戒断行为与细胞凋亡在吗啡成瘾、神经毒害等方面的关系，有望为戒断吗啡和脱瘾后复吸的治疗、预防提供新的研究思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。