HIF-1α、NGAL在不同程度慢性阻塞性肺疾病中的表达及与认知功能障碍的相关性研究

王亚楠 李娜 张甜甜

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种不完全可逆的以气道慢性炎症为主并伴有持续气流受限的肺部疾病，往往伴有认知功能障碍在内的多系统损害[1]。慢阻肺认知功能障碍是原发病慢阻肺 的合并症之一，使患者中枢神经系统受损，从而表现为对事物的认识、理解能力下降。研究[2]表明低氧、高碳酸血症、氧化应激及炎症反应均可能是导致慢阻肺患者并发认知功能障碍的危险因素。当机体出现低氧应激，可以导致患者体内出现血清低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)浓度改变，与此同时，患者可同时出现认知功能障碍[3]。中性粒细胞明胶酶蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)由中性粒细胞和某些上皮细胞分泌，在正常生理情况下其表达处于微量水平，而在急、慢性炎症反应中均显著升高[4]。此外，在慢阻肺及认知障碍的患者血浆中均表达升高[5]。目前已有研究[6]表明不同慢阻肺严重程度对患者认知功能的损害程度不同，但其原因尚不清楚，因此本研究探讨不同慢阻肺严重程度患者血清HIF-1α和NGAL水平与认知功能障碍间的相关性，以期为早期评估及预防慢阻肺合并认知功能障碍的发生提供依据。

资料与方法

一、病例资料

选取于2018年6月～2020年6月期间在本院呼吸科住院治疗的慢阻肺患者400例，根据纳入、排除标准纳入单纯慢阻肺患者80例(B组)，合并认知功能障碍患者78例，根据慢阻肺严重度将合并认知功能障碍患者分为2个亚组：稳定期 25例(C组)、急性加重期 53例(D组)，另选择同期门诊健康体检者60例为对照组(A组)。本研究已获我院伦理委员会审批，且试验方法严格按照相关实验规定。所有研究对象均知情同意，自愿参与研究，并签署知情同意书。

二、纳入、排除标准

1 慢阻肺患者

纳入标准：诊断标准符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》[7]：根据相关临床症状、危险因素及肺功能检查结果进行诊断，应用支气管扩张剂后第一秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 1 second, FEV1)/用力肺活量(forced vital capacity, FVC)<70%，可确定存在持续性气流受限，即诊断为慢阻肺。

排除标准：1)既往有肺部手术病史； 2)明确诊断为肺间质纤维化、肺结核、哮喘、支气管扩张；3)无法配合做肺功能检查；4)伴有严重精神类疾病；5)调查问卷填写不完整者。

2 合并认知功能障碍的慢阻肺患者

满足1.2.1的纳入、排除标准外，同时满足以下3点并能通过可操作性的客观指标进行量化：1)主诉或知情者报告认知功能下降；2)日常基本能力正常，但使用复杂工具的能力存在轻微损害；3)排除已进展至痴呆阶段。

排除标准：1)严重神经系统疾病患者；2)既往因慢阻肺以外的其他原因诊断为所致精神异常或认知功能障碍患者；3)文化程度过低，不具备基本认知能力的患者。

三、方法

1 一般资料调查

通过本院自行设计的问卷对受试者的基本情况进行收集，问卷的发放、回收均由经统一培训的研究人员参与，问卷回收时及时进行现场审核并查漏补缺。记录性别、年龄、受教育年限、吸烟史、糖尿病史、高血压史及冠心病史等信息。现场测量身高、体重，计算体质量指数(Body mass index, BMI)(BMI=体重(kg) /身高2(m2)。

2 HIF-1α和NGAL水平检测

由医生提前告知采血当天早晨7:00～9:00于空腹状态下采集静脉血。由护士抽取静脉血4 mL，分别收取血清和血浆，置于-80 ℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附法测定血清HIF-1α和血浆NGAL水平，试剂盒购于合肥莱尔生物科技有限公司，操作步骤均严格按照说明书进行。

3 动脉血气测定

采血时受试者手部放松，呼吸平稳，避免导致呼吸过度或者屏气而引起的血气误差。常规消毒后，由护士使用一次性动脉采血针在股动脉搏动最明显处垂直进针，采血约1mL后，拔出针头并迅速刺入橡皮塞内，立即送检标本。采用西门子epoc全自动血气分析仪，测定动脉血氧分压(arterial oxygen tension, PaO2)、动脉血氧饱和度(arterial oxygen saturation, SaO2)以及动脉血二氧化碳分压(arterial carbon dioxide tension, PaCO2)。

4 肺功能测定

待受试者坐下休息20 min后，应用德国 Erich Jaeger 公司肺功能仪，测定所有受试者的FVC、FEV1。受试者在检测者的指挥下做几次平静呼吸，缓慢将气体一次性呼出，接着快速吸气，然后立刻用最大力气将气体全部呼出，直至不能呼出为止，中间不能停顿、换气。通过受试者的年龄、身高和体重推算FVC和FEV1的预测值，分别计算二者实测值占预测值的百分比FEV1(%)、FVC(%)以及 FEV1/FVC 值。

5 认知功能评价

患者认知功能的评价由研究人员采用简易精神状态量表(mini mental state examination, MMSE)[8]提问的方式进行筛查。MMSE共30道题目，包括时间、空间定向力，即刻、延迟记忆力，注意力及计算力，语言表达力等内容。患者回答正确一项计为1分，回答错误或回答不知道计为0分，总分0～30分，其中24分以下初步认定为认知功能障碍，并由专科医师进行最终临床诊断；27～30分为正常(其中对于受教育年限<9年者，在原得分基础上加1分进行校正)。

四、统计学方法

结 果

一、基线资料比较

四组年龄、性别、受教育程度、BMI均无显著统计学差异(P>0.05)，B、C、D组吸烟史、糖尿病史、高血压史及心血管病史均显著高于A组(P>0.05)，而B、C、D组间无显著统计学差异(见表1)。

表1 四组基线资料比较

二、各组认知功能、肺功能、动脉血气及血清HIF-1α和NGAL浓度比较

与A组相比，B、C、D组FEV1、FVC、FEV1/FVC、PaO2、SaO2、MMSE均显著降低，而PaCO2、NGAL和HIF-1α均显著升高(P<0.05)；与B组相比，C、D组上述指标差异均具有显著统计学意义(P<0.05)；与C组相比，D组FEV1、FVC、FEV1/FVC、PaO2、MMSE均显著降低，NGAL和HIF-1α均显著升高(P<0.05)(见表2)。

表2 各组认知状态、肺功能、动脉血气及血清HIF-1α和NGAL浓度比较

三、慢阻肺患者合并认知功能障碍的多因素 logistic 回归分析

以是否MMSE分数<24(即是否合并认知功能障碍)为因变量，将上述患者比较差异有统计学意义的因素纳入多因素logistic回归分析，其中FEV1<60%、PaO2<70 mmHg、HIF-1α≥400 pg/mL和NGAL≥3.5μg/L为慢阻肺合并认知功能障碍的独立危险因素(P<0.05)(见表3)。

表3 慢阻肺患者合并认知功能障碍的多因素logistic回归分析

四、慢阻肺合并认知功能障碍患者MMSE与FEV1、PaO2、HIF-1α、NGAL的相关性

慢阻肺稳定期和急性加重期合并认知功能障碍患者MMSE评分与HIF-1α和NGAL呈显著负相关，与FEV1和PaO2呈显著正相关(P<0.05)，急性加重期r值(Pearson 相关系数)均高于稳定期(见表4)。

表4 慢阻肺合并认知功能障碍患者MMSE与FEV1、PaO2、HIF-1α、NGAL的相关性

五、HIF-1α联合NGAL预测慢阻肺合并认知功能障碍的ROC曲线分析

ROC曲线分析HIF-1α和NGAL预测慢阻肺患者合并认知功能障碍的最佳临界值分别为405.63 pg/mL和2.56μg/L，曲线下面积分别为0.726和0.745，二者联合曲线下面积为0.829(95%CI:0.816～0.882,P<0.001)，预测价值更高(见表5,图1)。

表5 HIF-1α和NGAL对慢阻肺患者合并认知功能障碍的预测价值

图1 ROC曲线分析HIF-1α和NGAL对慢阻肺患者合并认知功能障碍的预测价值

讨 论

慢阻肺是一种常见的慢性呼吸系统疾病，研究表明慢阻肺患者长期气道阻塞，容易导致缺氧、CO2潴留，同时由于肺部炎症介质、趋化因子的溢出等因素，影响全身血液循环并引起系统性炎症性反应。由于对缺氧和炎症反应最敏感，中枢神经系统作为最重要的肺外受累靶器官，能够造成认知功能障碍[9]。研究[10]显示约10.4% 慢阻肺患者并发认知功能障碍。Ozyemisci-Taskiran[11]等研究结果则表明，约22.6%急性加重期慢阻肺患者、8.8%稳定期慢阻肺 患者并发认知功能障碍。本研究中慢阻肺 并发认知功能障碍总发生率为19.5%，其中稳定期慢阻肺认知功能障碍患者约占6.25%，急性加重期约13.25%，发生率介于以往研究之间。

本研究发现随着疾病严重程度的增加，患者认知功能、肺功能、动脉血气等相关指标越差，尤其是合并认知功能障碍的急性加重期慢阻肺患者。进一步的相关分析表明不同疾病严重程度的MMSE评分与FEV1和PaO2均呈显著相关性，急性加重期组Pearson相关系数更高，表明慢阻肺患者的疾病严重程度能够影响其认知功能，慢阻肺病情越严重对患者认知功能的损伤也越大，这可能与急性加重期慢阻肺患者肺功能及动脉血气指标更差，体内炎症反应及缺氧更严重有关。Kakkera[12]等研究也表明重度慢阻肺患者的认知功能显著低于轻中度患者。PaO2与认知功能相关，尤其在注意力、行动力及语言能力方面[13]。Von Siemens[14]等研究显示PaO2与慢阻肺患者认知功能呈正相关。Xie[15]等人表明重度慢阻肺患者的认知功能与FEV1成正相关，我们的结果与以往研究一致。

缺氧是慢阻肺患者认知功能障碍的主要原因，主要影响患者的注意力、记忆力及执行能力[16]。Wang[17]等证实伴有低氧血症的慢阻肺患者认知功能障碍发生率明显增高。HIF-1α是一种机体缺氧应答的全局性调控因子，常氧条件下HIF-1α 被降解而表达很少，低氧条件下HIF-1α被激活而大量表达。患者机体缺氧时，HIF-1α一方面通过调节细胞的适应性，发挥重要的应答作用，使缺氧的组织、细胞对低氧的耐受性提高；另一方面，当患者机体发生认知障碍时，HIF-1α发挥其对大脑的保护作用，刺激大脑组织血管增生，促进脑部供血，增加供氧，从而减轻认知功能障碍[18]。在本研究中，慢阻肺认知功能障碍患者血清HIF-1α水平显著升高，且HIF-1α的升高水平与MMSE评分的下降水平呈显著相关性。戈艳蕾[19]等研究也显示当老年慢阻肺患者体内存在低氧应激情况时，能够导致血清HIF-1α增高。Liu[20]等发现随着认知功能障碍的加重，血清HIF-1α水平升高。

长期慢性缺氧也是使机体处于氧化应激状态并产生系统性炎性反应的病理基础，炎症及氧化应激反应又是慢阻肺并发认知功能障碍的另一主要原因。研究[21]证实，氧自由基产生、胶质细胞活化、神经元损害等造成的脑结构、功能变化，是影响认知功能的直接因素。NGAL在这一过程中可被巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞释放出来，抑制细菌生长，增强基质降解并参与慢阻肺氧化应激反应。NGAL发挥保护性作用的机制可能通过改善氧化应激及病理状态下的毒性作用实现[22]，Tondo 等[23]发现NGAL可能在轻度认知障碍进展为阿尔兹海默症的炎症过程中发挥作用。本研究发现NGAL在慢阻肺认知功能障碍患者血清中表达升高，且与MMSE评分呈显著负相关，可能与NGAL参与的炎症和氧化应激反应有关，具体作用机制仍有待进一步研究。

ROC曲线分析发现HIF-1α和NGAL联合作用时对慢阻肺合并认知功能障碍具有较高的预测价值，因而对于血氧降低和反应迟钝的慢阻肺患者可考虑进行血清HIF-1α和NGAL的检测，这对于临床早期发现患病高危人群、及时预防病情进展，具有一定的参考价值。

综上，本研究发现慢阻肺患者疾病严重程度能够影响患者的认知功能状态，慢阻肺合并认知功能障碍患者认知功能与血清HIF-1α和NGAL呈负相关，联合检测血清HIF-1α和NGAL水平能够为临床筛查和预防提供参考。