HPLC法测定复方氨酚美沙糖浆中对氨基酚含量

蔡锦雄，江 坤，陈颜清，刘 敏，李玉兰

（深圳市药品检验研究院/深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳 518057）

复方氨酚美沙糖浆为复方制剂，含有对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬、盐酸甲基麻黄碱、愈创甘油醚和马来酸氯苯那敏5 个药物活性成分，临床用于普通感冒或流行性感冒引起的发热、头痛、四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕和咳嗽等症状。处方中对乙酰氨基酚用量较大，在《中国药典》[1]2020 年版（二部）中，含对乙酰氨基酚的品种，控制的主要杂质均有对氨基酚。对氨基酚毒性较大，其主要来源为合成过程中的原料残留或贮藏过程中降解产生[2，3]，而复方氨酚美沙糖浆的现行标准[4]中，未对其进行控制。本文参考《中国药典》对乙酰氨基酚品种相关方法，建立了高效液相色谱法测定复方氨酚美沙糖浆中对氨基酚含量的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2695-2998 高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XS205DU 电子天平（瑞士梅特勒公司），UW620H 电子天平（日本岛津公司）；Milli-Q Reference 纯水器（德国默克密理博公司）。

1.2 材料 对氨基酚对照品（中国药品检验研究院，批号100802-201604，含量100%）；乙酸铵（阿拉丁，阿拉丁，批号C1915017），甲醇（色谱纯，德国默克公司，批号I1095607022）；复方氨酚美沙糖浆（国内某公司，批号19111712、19111812、19111912）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent SB C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为0.05 mol/L 醋酸铵溶液，流动相B 为甲醇，按表1 进行梯度洗脱；流速为1.0 ml/min；柱温为30 ℃；进样量为20 μl；检测波长为231 nm。

表1 HPLC 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 取对氨基酚对照品15 mg，精密称定，至100 ml 量瓶中，加溶剂0.05 mol/L 醋酸铵-甲醇（90∶10）使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml，至50 ml 量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 供试品溶液制备 用内容量移液管精密量取本品1 ml，置5 ml 量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

2.2.3 灵敏度溶液制备 精密量取对照品溶液1 ml，置10 ml 量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

2.2.4 分离度溶液制备 精密量取等量对照品溶液和供试品溶液，混合均匀。

2.3 系统适用性试验 分别取分离度溶液和灵敏度溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，色谱图见图1。结果显示，在分离度溶液中，对氨基酚的保留时间约为4.9 min，与相邻杂质峰的分离度均大于5.0，理论板数为8108，拖尾因子为1.5；在灵敏度溶液中，对氨基酚峰的信噪比为24。

图1 分离度溶液色谱结果

2.4 专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液和空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，色谱图见图2，结果显示空白溶剂对测定无干扰。

图2 专属性试验结果

2.5 线性关系试验 精密称取对氨基酚对照品约15 mg，加溶剂并稀释制成浓度为0.30～15.18 μg/ml 的系列溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归。结果显示，对氨基酚在0.30～15.18 μg/ml 浓度范围内线性良好，线性回归方程为y=72270.4x-983.8，相关系数r=1.000。

2.6 准确度试验 精密量取本品（批号19111712）1 ml，置5 ml 量瓶，分别加入浓度为15 μg/ml 对氨基酚溶液0.8、1.0 和1.2 ml，加溶剂稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件进行测定，依法计算回收率，结果显示，平均回收率为100.30%，RSD 为0.90%（n=9）。

2.7 重复性试验 本品（批号19111712）6 份，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示，6 份供试品溶液均未检出对氨基酚峰，方法重复性良好。

2.8 检测限及定量限试验 取“2.5”线性溶液依法稀释，作为检测限和定量限溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示，对氨基酚的检测限为0.1 μg/ml（0.002%），定量限为0.2 μg/ml（0.005%）。

2.9 耐用性 取3 根不同型号的色谱柱（Agilent SB C18、WatersXBridgeC18 和Kromasil 100-5C18，规格均为4.6 mm×250 mm，5 μm），在3 台不同品牌仪器上，按“2.1”项下色谱条件进行测定系统适用性溶液，结果见表2。结果显示该法耐用性良好。

表2 耐用性结果

2.10 稳定性 取对照品溶液，在样品仓温度为15 ℃条件下，连续考察12 h，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示，对照品溶液随着时间的推移，对氨基酚峰峰面积逐渐减小，在3 h 内稳定，溶液需临用新制。

2.11 样品测定 取3 批样品，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示3 批样品均为检出对氨基酚峰。

3 讨论

液相色谱方法的确定高效液相色谱法的基本原理是在高压力下，利用不同组分与固定相和液体流动相作用力不同，实现分离的色谱方法。目前已成为药物分析与药品检验的主流分析方法[5]。复方氨酚美沙糖浆为复方抗感冒药品，其处方中具有解热镇痛的对乙酰氨基酚组分含量最高，而对氨基酚为对乙酰氨基酚的主要杂质，且该杂质毒性较大[6，7]，需进行控制。故建立了高效液相色谱法测定复方氨酚美沙糖浆中的对氨基酚含量。

流动相系统选择在《中国药典》2020 年版二部中，对氨基酚的检查项下，流动相系统主要有磷酸盐（含四丁基氢氧化铵）-甲醇系统、磷酸盐（pH4.5）-甲醇系统、醋酸铵-甲醇系统和辛烷磺酸钠（pH3.0）-乙腈系统。经考察，在0.05 mol/L 醋酸铵-甲醇（85∶15）系统中，对氨基酚峰峰型良好，与相邻色谱峰分离较好。但对氨基酚峰出峰较早，且本品处方组成复杂，右美沙芬等在该系统中保留能力较强，故将起始流动相优化为0.05 mol/L 醋酸铵-甲醇（90∶10），使对氨基酚峰出峰时间更适宜，并将系统进一步优化为梯度系统，使方法准确性和耐用性等更佳。

检测波长选择采用二极管阵列检测器，考察对氨基酚对照品溶液和加标供试品溶液，其对氨基酚峰的3D 图谱显示，在231、297 nm（或298 nm）有最大吸收峰，其中，231 nm 吸收峰强度更高，且在该波长下，无其他色谱峰干扰，故选择测定波长为231 nm。

溶剂的选择查看《中国药典》2020 年版二部测定对氨基酚的该流动相体系，溶剂均采用流动相，经进一步试验，使用0.05 mol/L 醋酸铵-甲醇（90∶10）作为溶剂时，对氨基酚对照品和供试品溶液均能完全溶解，且方法学验证结果显示，该溶剂满足试验要求。

综上所述，本试验中采用高效液相色谱法测定复方氨酚美沙糖浆中对氨基酚的含量，方法操作简单、灵敏、结果准确，可用于该制剂的质量控制。