基于生物信息学分析PRMT5在头颈鳞癌中的表达及临床意义

王 楠，黄轩宇

（嘉应学院生命科学学院/广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州 514015）

头颈鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是人体常见的恶性肿瘤之一，2018 年全球癌症数据统计显示，头颈部癌症年新发病例约70 万，死亡病例约35 万，其发病率和死亡率正逐年增加，已成为危害生命健康的重要疾病之一[1，2]。头颈部癌症常发生于口腔颌面部、咽、喉、鼻腔/鼻窦等部位，其中90%以上组织病理类型为鳞状细胞癌。在目前较先进的治疗标准下，中晚期患者的5 年生存率并没有得到较大改善，发生颈部淋巴结转移的患者5 年生存率仅30%～40%；发生远处转移时，患者5 年生存率不足20%[3，4]。迄今为止，临床上对头颈鳞癌患者的诊断、治疗和预后都是以TNM 分期为依据来制定和判断，逐步建立有效的个性化评价指标和评价体系具有深远意义。因此，深入探究头颈鳞癌转移的分子机制及影响预后的因素，寻找可用于分子诊断及靶向治疗的肿瘤标记物，是头颈鳞癌治疗中亟待解决的问题。精氨酸甲基转移酶5（PRMT5)是PRMT 蛋白家族成员之一，属于Ⅱ型精氨酸甲基化转移酶，可以通过甲基化组蛋白或非组蛋白实现对基因的转录调控[5]。PRMT5 还可与多种不同的表观遗传调控复合物结合，通过调节靶基因的表达参与细胞增殖、DNA 复制、细胞周期、侵袭和转移等过程[6-8]。有研究报道[9]，在上皮样肿瘤中的PRMT5 可以与Snail 结合，抑制E-cadherin 蛋白表达，导致细胞发生恶性转化促进肿瘤转移。PRMT5 高表达水平直接与肿瘤的进程及不良预后密切相关[10，11]。PRMT5 的抑制剂GSK591 能够在体外显著抑制小鼠细胞的增殖，诱导凋亡[12]。这些研究表明PRMT5可能是潜在的癌基因，但其调控头颈鳞癌进展的研究国内外开展甚少。本研究通过多种生物信息学数据库挖掘PRMT5 在头颈鳞癌中的表达情况，探讨PRMT5 在头颈鳞癌发生发展中的作用，为PRMT5在头颈鳞癌中的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 UALCAN-TCGA 数据库分析 UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[13]是一个有效的癌症数据在线分析和挖掘工具，主要是基于TCGA 数据库的在线分析和挖掘。利用UALCAN 数据库分析PRMT5 在头颈鳞癌中的表达情况。检索条件如下：①在Enter gene symbol 输入PRMT5；②TCGA dataset Select cancer 栏选择Head and Neck squamous cell carcinoma，点击Explore；③Links for analysis 选择Expression。

1.2 GEPIA 数据库分析 GEPIA 数据库是一个高度可视化数据库，该数据库整合了TCGA 癌症大数据和GTEx 正常组织大数据[14]。运用该数据库分析PRMT5 表达与头颈鳞癌患者的预后及分析其与免疫检查点基因之间的相关性。检索条件如下：①在Enter gene name 检索栏输入PRMT5，点击GoPIA! ；②Survival 选择Survival plots；③Datasets Selection（Cancer name）选择HNSC。

1.3 HPA 数据库分析 HPA（https://www.proteinatlas.org/）是目前最大、最全面的人类组织细胞蛋白空间分布数据库。本研究利用HPA 数据库分析PRMT5 蛋白在正常组织和头颈鳞癌组织中的表达差异。检索条件如下：①在检索栏直接输入：PRMT5，点击Search；②PROTEIN EXPRESSION OVERVIEW：Oral mucosa；③选择合适的正常口腔组织细胞PRMT5 蛋白表达图；④点击PRMT5 栏中的Pathology；⑤PROTEIN EXPRESSION SUMMARY：Head and neck cancer。

1.4 Kaplan-Meier Plotter 数据库分析 利用Kaplan-Meier Plotter 数据库（http://kmplot.com/analysis/）[15]分析PRMT5 mRNA 表达与头颈鳞癌患者病理特征和总生存期（OS）的关系。检索条件如下：①点击mRNA（RNA-seq）列的Start KM Plotter pan-cancer；②Caner：Head-neck squamous cell carcinoma（n=500）；③Gene symbol：PRMT5；④Split patients by：选择median；⑤Restrict analysis to subtypes：选择all。

1.5 TIMER 数据库分析 TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是利用RNA-seq 表达谱数据检测肿瘤组织中免疫细胞浸润情况[16]。TIMER 提供（CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、B 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）6 种免疫细胞的浸润情况。利用TIMER 数据库分析头颈鳞癌内PRMT5 基因表达和六种免疫细胞浸润比例之间的关系。检索条件如下：①点击SCNA，在Cancer Types：选择HNSC；②Gene symbol：输入PRMT5，点击Submit。

1.6 STRING 数据库分析 STRING 11.0（https://string-db.org/）是研究蛋白质相互作用的数据库，可进行已知蛋白与预测蛋白之间的相互作用分析，包括直接相互作用和间接相互作用。本研究利用STRING 11.0 数据库分析PRMT5 蛋白与其它蛋白的相互作用，检索条件如下：①数据库中输入“PRMT5”；②在List Of Name 下方的Orginsim 选择Homo sapiens；③最后点击SEARCH 进行构建蛋白质互作网络然后导出tsv 文本文件；④用Cytoscape 3.7.2 打开导出的tsv 文件，用Cytohubba 插件对蛋白质相互作用网络进行关联度分析，并运用MCC 算法得到hub 基因。

1.7 统计学方法 利用SPSS 24.0 软件分析PRMT5表达水平与临床病理参数间的关系，Spearman 相关系数分析GEPIA 数据库中的基因表达相关性。采用GEPIA 数据库分析生存率，Log-rank 检验估计生存率的差异。通过TIMER 数据库中的GENE 模块分析PRMT5 基因与免疫浸润水平的关系。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PRMT5 在HNSC 癌组织和癌旁组织的差异表达从GEO 数据库中检索与头颈鳞癌相关的基因表达数据集GSE85195，用于基因表达的差异分析。以log fold change＞2 和P＜0.05 为筛选阈值，共鉴定出1911 个基因在口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中表达差异明显（图1A），其中PRMT5 呈高表达。通过UALCAN 数据库分析PRMT5 在头颈鳞癌中的mRNA 表达情况，发现PRMT5 mRNA 在头颈鳞癌组织中的表达高于正常组织（图1B）。

图1 PRMT5 在头颈鳞癌组织及正常组织中的表达

2.2 PRMT5 表达量与头颈鳞癌患者临床病理参数的相关性 通过UALCAN 数据库分析发现，TNM 临床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期头颈鳞癌患者组织中PRMT5基因表达水平均高于正常组织（图2A），Ⅲ期、Ⅳ期头颈鳞癌患者PRMT5 基因表达水平高于Ⅰ期头颈鳞癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PRMT5 高表达与头颈鳞癌肿瘤分级相关（图2B）。利用KMplotter 数据库进行数据整合，发现PRMT5 的表达水平与性别、等级、AJCC 临床分期及头颈鳞癌患者总生存率相关，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 PRMT5 基因表达与头颈肿瘤临床病理因素的相关性

图2 PRMT5 在头颈鳞癌不同临床分期和肿瘤分级中的表达

2.3 PRMT5 基因在头颈鳞癌中的预后分析 通过过GEPIA 数据库分析PRMT5 与头颈鳞癌患者的预后，结果显示PRMT5 高表达患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）较PRMT5 低表达患者显著降低（OS：P=0.0055，HR=1.5；DFS：P=0.041，HR=1.4），见图3。

图3 GEPIA 数据库分析PRMT5 对头颈鳞癌患者总生存期和无病生存期的影响

2.4 PRMT5 表达与头颈鳞癌免疫细胞浸润的关系运用TIMER 数据库分析PRMT5 表达与头颈鳞癌免疫细胞浸润的相关性，结果表明PRMT5 基因表达与细胞纯度、B 细胞、CD8+T 细胞、中性粒细胞的免疫浸润水平具有一定相关性（图4A），可能参与头颈鳞癌细胞的免疫浸润过程；另外头颈鳞癌组织与正常组织相比，PRMT5 不同拷贝状态对免疫浸润具有一定影响（图4B）。

图4 PRMT5 表达与头颈肿瘤免疫细胞浸润的关系

2.5 PRMT5 与免疫检查点之间相关性分析 通过GEPIA 数据库分析PRMT5 基因表达与头颈鳞癌中免疫检查点基因的相关性，结果提示PRMT5 基因与CD276、PD-L1、PVR 和TNFRSF18 等免疫检查点基因的表达水平呈正相关，见图5。

图5 头颈肿瘤中PRMT5 表达与免疫检查点基因的相关性

2.6 PRMT5 在头颈鳞癌组织中的表达分析 利用HPA 数据库分析PRMT5 蛋白在正常组织和头颈鳞癌组织中的表达差异，结果显示PRMT5 在头颈鳞癌组织中的表达高于正常组织，见图6。

图6 PRMT5 在头颈组织和正常对照组织中的表达差异

2.7 PRMT5 蛋白相互作用网络分析 用STRING 11.0数据库分析PRMT5 蛋白与其它蛋白的相互作用，得到可能与PRMT5 相互作用的蛋白互作网络结果，使用Cytoscape 中的插件Cytohubba 运用MCC 算法得到10 个枢纽基因，即CDK6、HIST1H4A、PRMT1、CLNS1A、COPRS、WDR77、SNRPD3、HIST4H4 和HIST2H2AC，见图7。

图7 PRMT5 相互作用的蛋白网络图

3 讨论

头颈鳞癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一。在过去的几十年，尽管手术、放化疗等综合治疗手段不断改善，但是头颈鳞癌患者的预后仍然较差，总体生存率维持在40%～60%。头颈鳞癌的复发和转移一直是患者死亡的主要原因。虽然病理分级、肿瘤分期和淋巴结转移等因素与患者预后相关，但这些指标尚不足以精确评估头颈鳞癌患者的预后。因此，深入研究头颈鳞癌的发病机制、寻找影响其预后的因素及可用于诊断和治疗的分子靶点，对实现头颈鳞癌的个体化治疗具有重要意义。

PRMT5 是PRMTs 家族中最早被鉴定出来的成员，其在肿瘤发生和发展中的作用被研究的最为深入。研究表明[9]，过表达的PRMT5 可促进细胞增殖和裸鼠体内肿瘤的形成。敲除PRMT5 的小鼠在3.5～6.5 d 胚胎致死，表明PRMT5 在胚胎发育中具有重要作用[17]。此外，敲除PRMT5 囊胚的胚胎干细胞ES 发育停滞，且分化基因表达上调而多能性基因表达下调，提示PRMT5 对维持干细胞的多能性是必需的[18]。PRMT5 的转录抑制作用使其在上皮-间质转化过程中发挥重要的作用，从而影响肿瘤细胞的侵袭转移[19,20]。这些研究表明PRMT5 可能是潜在的癌基因，但其调控头颈鳞癌进展的分子机制研究较少。本研究通过生物信息学方法对公共数据库中PRMT5 基因在头颈鳞癌中的表达情况进行深入挖掘、分析，避免因样本量、研究方法和人群个体差异导致的结果异质性。通过UALCAN 数据库分析发现，PRMT5 mRNA 在头颈鳞癌组织中的表达高于正常组织。这与有关报道[10，11]的研究结果一致，说明PRMT5 高表达水平直接与肿瘤的进程及不良预后密切相关。PRMT5 主要表达于细胞质，少量表达在细胞核，而对发生恶性转化的细胞其定位则相反[21]。PRMT5 在多种肿瘤中高表达使其有望成为头颈鳞癌及其他癌症诊断的标志物。本研究进一步分析发现，TNM 临床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期头颈鳞癌患者组织中PRMT5 基因表达水平均高于正常组织，PRMT5 高表达与头颈鳞癌肿瘤分期相关。利用HPA数据库分析发现，PRMT5 在头颈鳞癌组织中的表达高于正常组织，进一步在蛋白水平证明了高表达PRMT5 与患者的临床分期相关。通过Kaplan-Meier Plotter 数据库进行生存分析，发现PRMT5 高表达患者的总生存率较PRMT5 低表达患者降低，提示其表达与患者预后密切相关。

肿瘤的发生发展其本质上是复杂的，包括异质的细胞成分和肿瘤免疫微环境。在肿瘤发生、发展和转移的不同阶段，细胞-细胞相互作用（除癌细胞外，还包括血管和免疫细胞）以及细胞-细胞外基质相互作用（如周围基质的硬度和组成发生变化）起着主要作用。本研究利用TIMER 数据库分析发现PRMT5 基因表达与细胞纯度、B 细胞、CD8+T 细胞、中性粒细胞的免疫浸润水平具有一定相关性，提示PRMT5 有可能参与头颈鳞癌细胞的免疫浸润过程。另外，头颈鳞癌组织与正常组织相比PRMT5 不同拷贝状态对免疫浸润具有一定影响。进一步通过GEPIA 数据库分析得出PRMT5 基因与PD-L1、CD276、PVR 和TNFRSF18 等免疫检查点基因的表达水平呈正相关。因此，PRMT5 表达与免疫检查点基因表达分析的结果可以为头颈鳞癌的免疫治疗提供理论依据和研究新思路。

使用STRING 11.0 数据库进一步预测与PRMT5相互作用的蛋白，这些蛋白主要有CDK6、HIST1H4A、PRMT1、CLNS1A、COPRS、SNRPD1、WDR77、SNRPD3、HIST4H4 和HIST2H2AC。其 中CDK6 可 与PRMT5（p53 拮抗剂）的启动子结合，通过驱动细胞周期进程和拮抗应激反应在p53 和RB 的界面发挥作用[22]。PRMT5 和PRMT1 相互作用，在联合抑制剂治疗小细胞肺癌和胰腺癌细胞模型中具有协同作用。此外，PRMT5 可与MEP50/WDR77 复合物结合发挥作用，这种活性通常在癌细胞中处于激活状态，并与肺癌和胰腺癌不良预后相关，使PRMT5 成为治疗靶点[23]。组蛋白结合蛋白COPR5 是PRMT5 发挥核功能所必需的，在恶性胶质瘤细胞中CLNS1A/RIOK1 的比例可作为PRMT5 抑制剂敏感性的标志物，PRMT5 敲除干扰了内含子（DIs）的去除。这种受损的DI 剪接影响增殖基因，其下调与细胞周期阻滞、衰老和/或凋亡相关，这些发现揭示了PRMT5 调控的双剪接程序可作为癌症治疗的靶点[24，25]。

综上所述，PRMT5 在头颈鳞癌组织中高表达，其高表达与肿瘤的进程及不良预后密切相关；同时PRMT5 可能参与头颈鳞癌细胞的免疫浸润过程，并与一些免疫检查点基因的表达相关；PRMT5 通过与其他蛋白的相互作用参与细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期改变和代谢异常调控等过程，其有望成为头颈鳞癌的诊断标志物和新的治疗靶点。