新疆某牧场乳房炎奶样的细菌分离鉴定与药物敏感试验

2021-08-21陈明杰曹梦园王晨豫闫雪琪齐亚银

中国乳业 2021年7期

陈明杰，曹梦园，王晨豫，闫雪琪，齐亚银

石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000

0 引言

近年来，随着人们生活质量的提高，居民对乳制品的需求逐年增长，但随之而来的食品安全问题也越来越受到人们的重视[1]。

目前，乳房炎仍然是奶牛养殖过程中最常见和最严重的疾病之一，在我国的发病率达到了60.0%～70.0%，每年给我国奶牛养殖业造成巨大的损失[2，3]。预防乳房炎对提升我国乳制品质量安全水平具有重大意义[4]。奶牛乳房炎主要有两种常见致病菌：一是传染性病原菌，包括无乳链球菌、金黄色葡萄球菌等；二是环境性病原菌，包括大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、肠球菌等[5]。

奶牛乳房炎也会给牧场带来很多损失，如导致牛奶废弃、奶牛淘汰、用药后的药物残留，乳制品品质下降等[6]。因此，对乳房炎致病菌进行分离鉴定并提供相应的治疗，预防方案十分必要[7]。

本试验为查明某规模牧场奶牛乳房炎致病菌，首先采集乳房炎奶样，然后结合常规微生物学及实验室诊断方法，对该场的乳房炎致病菌进行分离鉴定及药物敏感试验（以下简称“药敏试验”），并给出临床用药建议[8]，以期为奶牛乳房炎临床治疗及预防提供指导意见。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021年4月，在新疆某牧场采集40 头患有乳房炎奶牛的奶样，经4 ℃保存运输。

1.2 主要试剂及药品

肉汤（LB）培养基、LB琼脂（上海生工生物工程股份有限公司）；无菌脱纤维绵羊血（德宁生物）；甘露醇高盐琼脂、麦康凯培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；革兰氏染色液（珠海贝索生物技术有限公司）；药敏试纸选择为：磺胺嘧啶、头孢喹肟、青霉素、林可霉素、链霉素、庆大霉素、多西环素、林可霉素、卡那霉素、氨苄西林、强力霉素、头孢噻吩、阿莫西林和环丙沙星等（杭州滨和微生物试剂有限公司）；DNA marker（南京诺维赞）；DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。

1.3 乳房炎菌株的筛选及鉴定

1.3.1 菌株筛选

试验全程无菌操作，取一环乳样接于LB肉汤培养基中，37 ℃摇床过夜。将浑浊菌液采用环线手法分别接种在甘露醇高盐平板、麦康凯平板、血琼脂平板上，37 ℃温箱培养18～24 h。观察不同平板上的菌落形态。挑取麦康凯平板上红色、边缘光、湿润的菌落；血琼脂平板上溶血的菌落；甘露醇高盐平板上黄色的单个菌落（该菌落周围的培养基颜色也发黄），进行涂片，染色镜检。同时将上述疑似菌株再进行分离纯化。

1.3.2 分离菌株的鉴定

对分离菌株进行聚合酶链式反应（PCR）鉴定。按照全式金提取试剂盒说明书提取细菌DNA并保存备用。所选大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌引物如表1。

表1 引物序列

1.4 分离菌株的药敏试验

1.4.1 分离菌株的药敏表型检测

把经过分离得到的大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌分别接种于LB肉汤培养基中，培养24 h后，用生理盐水将菌液浓度调节至（1～2）×10 CFU/mL。按纸片法的操作，吸取适量菌液涂布在琼脂平板上，取出不同药敏纸片，贴于琼脂表面，不同药敏纸片的间距至少24 mm。将平板置于温箱培养24 h后，测量琼脂上的抑菌环直径。

评判结果参照美国临床实验室国家标准化管理委员会标准（CLSI2008）。