积雪草酸通过调控Nrf2/NF-κB治疗MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的实验研究

胡义阳 杨忠明（泉州市第一医院，泉州362000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种复杂的自身免疫性疾病，其特征在于自身抗体的产生、全身性炎症以及对血管和器官的损害［1-2］。SLE是由遗传和环境因素引起的多因素疾病。许多SLE易感基因负责维持免疫耐受性和内环境稳定，如抗原加工和呈递、细胞凋亡、白细胞表面受体以及细胞信号传导和基因转录的分子［3-4］。近年来，氧化应激因其在系统性红斑狼疮发病机理中的潜在作用而引起了广泛关注。狼疮性肾炎是SLE患者肾功能衰竭的主要原因，其氧化状态受损，与狼疮性肾炎的进展有关。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡状态，可通过激活NF-κB（NFκB）并刺激随后产生促炎细胞因子和趋化因子以促进慢性肾病而诱发炎症。核因子E2相关因子2（Nrf2）的抗氧化信号通路在细胞抵抗氧化应激的防御中发挥重要作用，并且已证明Nrf2基因的消融可引起狼疮样自身免疫性肾炎。Nrf2通过调控抗氧化物质的表达，减轻活性氧和亲电体引起的细胞损伤，使细胞处于稳定状态，维持机体氧化还原动态平衡［5］。在人类和小鼠模型中有研究报道Nrf2参与系统性红斑狼疮的发病机制，但Nrf2在狼疮性肾炎发展中的作用仍不清楚。积雪草酸是积雪草的三萜类衍生物，具有诸如抗氧化剂和抗炎等生物学作用，有很大的研究价值［6-7］。既往已报道积雪草酸的多种潜在治疗作用，但积雪草对狼疮性肾炎的作用了解甚少。本研究将探讨积雪草酸对小鼠狼疮性肾炎的作用及其调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料积雪草酸购自上海自然标准研发与生物技术有限公司（纯度98.0%、分子量488.70）。本实验一抗：Nrf2抗体、p47phox抗体、Histone H3抗体、β-actin抗体、CD3抗体、F4/80抗体、NF-κB抗体均购自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）。TRIzol试剂购自Invitrogen；凝胶电泳系统购自北京六一仪器厂；凝胶电泳转移系统购自BIO-RAD；PVDF膜购自美国Millipore；化学发光蛋白检测显影液购自美国Borad。BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。MRL/lpr雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。荧光显微镜（IX53）购自日本奥林巴斯。

1.2 方法

1.2.1 动物分组选择20只8周野生型雌性BALB/c小鼠为正常组（Normal组），分别选择20只易患狼疮的MRL/lpr雌性小鼠给予生理盐水［10 ml/（kg·d）］和积雪草酸［10 ml/（kg·d）］，作为对照组（Vehicle组）和实验组（Asiatic acid组），均以灌胃方式给药。实验中对动物的处置符合3R规则。所有操作遵循动物护理和使用委员会批准（动物伦理批号：2019016）。各组手术过程和实验数据分析采用单盲模式。将动物维持在12 h光照/12 h黑暗交替环境中并自由获取食物和水，在实验前适应条件至少7 d。各组小鼠12周龄进行灌胃，至34周采用颈椎脱臼处死法迅速处死小鼠进行取材。

1.2.2 RT-PCR从肾脏组织提取总mRNA，分光光度计检测RNA浓度和纯度，按试剂盒说明书反转录cDNA。qPCR引物序列如下（Primer Premier 5.0软件设计），GAPDH-F：5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，GAPDH-R：5'-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'；HO-1-F：5'-AGGTACACATCCAAGCCGAGA-3'，HO-1-R：5'-CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT-3'；NQO1-F：5'-GTGATATTCCAGAGTAAGAAGGCAG-3'，NQO1-R：5'-ATTCTCCAGGCGTTTCTTCCAT-3'。LightCycler®80 SYBR GreenⅠMaster用于上机检测还原型辅酶Ⅰ醌氧化还原酶1［NAD（P）H quinine oxidoreductase，NQO1］和血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）mRNA表达水平，使用GAPDH的mRNA表达量作为内参进行标准化，即以NQO1/GAPDH和HO-1/GAPDH表示结果。

1.2.3 免疫组织化学染色经4%多聚甲醛溶液固定的肾脏组织脱水，石蜡包埋切片后，在60℃烤箱中烘烤30 min以上，经脱蜡水合后用柠檬酸盐高压修复。8%羊血清封闭60 min减少非特异性染色。用CD3、F4/80、NF-κB一抗孵育过夜，二抗孵育60 min后，每个组织加DAB工作液进行显色，苏木素复染后中心树胶封片，在光学显微镜下观察并拍照。

1.2.4 Western blot将各组小鼠肾脏组织溶于裂解缓冲液中，采用BCA法测量蛋白浓度。组织裂解产物使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h。孵育一抗4℃过夜。37℃孵育二抗40 min后用ECL进行显影。使用Image J软件对蛋白表达水平进行定量，GAPDH为内参蛋白。

1.2.5 HE染色标本采集：将小鼠仰卧捆绑于小动物手术台上，取肾脏组织，置于4%多聚甲醛溶液中，固定72 h后将其进行乙醇梯度脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，切成5µm薄片，进行后续组织HE染色。

1.2.6 活 性 氧（reactive oxygen species，ROS）测定通过Dihydroethidium（DHE）染色检测活性氧的产生。将肾脏石蜡切片与DHE（5 µmol/L）在37℃孵育1 h，用荧光显微镜（IX53）观察荧光图像，由Image-Pro plus软件进行分析。

1.3 统计学分析使用SPSS22.0统计软件进行统计分析。计量资料以±s表示。两两比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肾脏HE染色结果如图1所示，对照组小鼠显示典型的肾小球增生、新月体、肾小球硬化和间质性炎症，表现为肾小球周围单核白细胞浸润以及伴有蛋白管型的肾小管萎缩，而正常组小鼠无异常表现。在积雪草酸实验组小鼠中，上述肾脏损伤大幅减少，但与正常组小鼠比较仍表现出轻度肾小球增生和轻度间质性炎症。

图1 各组小鼠肾脏HE染色（×400）Fig.1 HE staining of mice kidney in each group（×400）

2.2 各组小鼠肾脏活性氧的测量为了特异性地检测各组肾脏中的局部活性氧产生情况，采用DHE染色法检测各组小鼠肾脏中ROS表达水平。如图2所示，DHE荧光在正常组小鼠肾脏中较低，阳性细胞率小；在对照组小鼠中显著增加（P＜0.05），与正常小鼠相比ROS水平显著增加。在积雪草酸处理后ROS产生较少（P＜0.05）。

图2 各组小鼠肾脏DHE染色（×400）Fig.2 DHE staining of kidney of mice in each group（×400）

2.3 各组小鼠肾脏组织中的氧化应激蛋白相对表达水平比较为确定积雪草酸给药是否影响狼疮性肾炎的氧化应激反应，对肾脏中Nrf2向细胞核的移位和NAD（P）H氧化酶亚单位p47phox水平以及Nrf2下游酶进行了检测。如图3所示，与正常组相比，对照组小鼠细胞核中的Nrf2蛋白水平显著低于正常对照组（P＜0.05），然而与对照组小鼠相比，积雪草酸处理的小鼠Nrf2向细胞核的移位明显增多（P＜0.05），其水平与正常组接近。另外与正常小鼠相比，对照组小鼠中p47phox的水平显著增加（P＜0.05），而经过积雪草酸治疗的小鼠其p47phox的水平显著降低（P＜0.05）。

图3 各组小鼠肾脏氧化应激蛋白表达水平Fig.3 Expression level of oxidative stress protein in kidney of mice in each group

2.4 各组小鼠肾脏组织中mRNA相对表达水平比较既往研究表明，NQO1和HO-1的表达受Nrf2调控［8］。因此本研究检测NQO1和HO-1的mRNA在各组小鼠肾脏组织中的表达。如图4所示，与正常组小鼠相比，对照组小鼠中NQO1和HO-1的肾mRNA水平显著降低（P＜0.05），在积雪草酸处理后的小鼠中NQO1和HO-1的肾mRNA水平与正常组相似（P＜0.05）。

图4 各组小鼠肾脏组织中的mRNA相对表达水平Fig.4 Relative mRNA expression levels in kidney tissues of mice in each group

2.5 各组小鼠肾脏氧化应激蛋白的表达水平免疫组化结果（图5）显示，与正常组相比，对照组显示出T细胞（CD3阳性细胞）和单核细胞/巨噬细胞（F4/80阳性细胞）显著浸润到肾间质的肾小球周围区域（P＜0.05），而积雪草酸处理的小鼠CD3和F4/80的表达水平显著下降（P＜0.05）。与正常组相比，对照组小鼠肾脏中的NF-κB p65活性显著增加（P＜0.05），且这种作用在积雪草酸处理的小鼠中被显著抑制（P＜0.05）。

图5 各组小鼠肾脏组织免疫组化染色结果Fig.5 Immunohistochemical staining results of kidney tissues of mice in each group

3 讨论

本研究发现积雪草酸可抑制MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的发生发展。积雪草酸通过减少肾小球增殖、新月体、肾小球硬化和肾小球周围单核白细胞浸润，抑制MRL/lpr小鼠狼疮肾炎的发展。进一步机理研究表明，积雪草酸改善MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎是通过增强Nrf2抗氧化信号通路、抑制NF-κB炎症信号通路以及抑制肾内T细胞和单核细胞/巨噬细胞的浸润实现的。

狼疮性肾炎患者的氧化状态受损且炎症活动明显增加［9］。既往研究发现狼疮肾炎的发展和加速都与受损的抗氧化防御系统有关［10-11］。积雪草酸是一种从积雪草中提取的生物活性化合物，具有多种诸如抗氧化和抗炎等药理作用［7，12-13］。据报道，在创伤性脑损伤或急性肺损伤的小鼠模型中，Nrf2的破坏导致促炎细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6的产生增加，并且Nrf2通过中和活性氧并负调节NF-κB和TGFβ1信号通路来改善狼疮性肾炎［14-16］。最近的一项研究表明，通过增加Nrf2水平和肝脏抗氧化酶活性，积雪草酸显著改善了肝功能损伤［12］。阻断氧化应激可通过降低IL-1β和TNF-α的表达来改善肾脏炎症［17-18］。本研究证明积雪草酸显著抑制MRL/lpr小鼠活性氧生成，激活其Nrf2信号通路，抑制p47phox和NF-κB的表达，促进血红素氧合酶-1和NAD（P）H氧化酶下游的NQO1表达增加。另外，T细胞和巨噬细胞向肾脏的浸润在肾小球肾炎中也起着重要作用［19-20］。免疫组化染色结果证实积雪草酸给药可抑制MRL/lpr小鼠肾内T细胞和单核细胞/巨噬细胞的浸润。

综上所述，本研究证明了积雪草酸通过Nrf2/NF-κB信号通路对系统性红斑狼疮肾脏的氧化应激具有保护作用，具有治疗狼疮性肾炎的应用前景。