IL-6/STAT3信号通路与肝癌研究进展①

柳辉 郭乐 丁淑琴 李元 姜中佳（宁夏医科大学临床医学院，银川750004）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝脏常见肿瘤，恶性程度较高，临床治疗难度大，且预后极差。全球每年约有80万人罹患肝癌。我国每年新发肝癌病例约为35～40万例，HCC死亡总人数占全球死亡病例50%以上［1］。肝癌发生发展是多基因调控及多因素相互作用的复杂过程。研究认为，“非可控性炎症”是HCC的重要特征，持续或低强度的炎症刺激可导致过量炎症因子表达，引发原癌基因活化和抑癌基因失活，促进肿瘤发生发展。因此，深入研究炎症因子在HCC发生发展中的功能及分子机制，同时抑制其在HCC中的过度表达，是基础科研及临床治疗的重要目标。

1 肝癌组织中IL-6表达

IL-6可由单核细胞、T细胞、成纤维细胞和内皮细胞等多种细胞合成和分泌，是一种多效性细胞因子，在肿瘤微环境中含量丰富，对肿瘤发生发展具有潜在作用［2］。研究认为，IL-6高表达及异常信号通路与HCC患者免疫缺陷及预后密切相关。田爱平［3］发现，诱导性肝癌组织中IL-6表达水平显著高于癌旁组织，通过质粒转染过表达IL-6，肿瘤重量及体积明显高于转染空质粒载体的阴性对照组，同时细胞活力、增殖能力显著增强。LIU等［4］研究发现，IL-6高表达可通过募集免疫抑制细胞，如髓系来源抑制细胞，在HCC微环境中诱导强免疫抑制。研究显示，阻断IL-6可显著增强HCC抗肿瘤免疫作用。此外，徐倩［5］通过制备新型单克隆抗体HC6R1证实，阻断IL-6可显著抑制HCC细胞HepG2和Huh7增殖、迁移、黏附和侵袭。

2 IL-6/STAT3信号通路

IL-6受体系统由2种跨膜蛋白组成：一是负责信号转导，相对分子质量为13 0000的非配基结合链糖蛋白130（gpl30，也称CD130或IL-6R0）；另一部分是可与IL-6直接结合，相对分子质量为80 000的配基结合链IL-6Rα（又称CD126或gp80）。其中IL-6Rα可分为膜结合型（membrane-bound IL-6R，mIL-6R）和可溶型（soluble IL-6R，sIL-6R）2种，研究认为mIL-6R是触发IL-6信号传导的最主要途径。相应靶细胞表面，IL-6与mIL-6R首先结合，并诱导mIL-6R自身构型变化，继而与gp130胞外端紧密结合，诱导mIL-6R/gp130蛋白复合物形成，促使gp130迅速发生同二聚化作用，激活信号，这种信号激活途径即为经典信号传导途径（图1A）［6］。mIL-6R仅表达于肝细胞和部分白细胞亚型，不表达mIL6-R的 细 胞 中，IL-6还 可 与sIL-6R结 合 激 活gp130，发挥生物学效应，这种信号转导方式称为反式信号途径（图1B）。近年研究发现，sIL6-R主要由mIL6-R胞外部分裂解产生，依赖于解聚素和金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM）基因家族成员的限制性蛋白水解作用及mRNA的选择性剪接作用［7］。信号被激活后，二聚化gp130通过Janus激酶（Janus kinase，JAK）磷酸化进一步级联诱导STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3形成二聚体，转移至细胞核，激活调控基因转录活性，通过级联信号传递发挥生物学效应。

图1 IL-6参与肿瘤发生发展的机制Fig.1 Mechanism of IL-6 involved in tumorigenesis and development

大多数HCC患者体内IL-6/STAT3信号均异常激活，研究表明，几乎所有IL-6家族的细胞因子均能激活STAT3蛋白，同时，STAT3也被认为是介导IL-6功能的最主要转录因子［8］。信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription proteins，STATs）在细胞信号传递方面具有重要作用，其家族成员分别为STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，其中STAT3在炎症和肿瘤形成中具有重要作用。STAT3在肝癌细胞中异常激活，除影响肿瘤细胞增殖、转化、侵袭、血管生成和凋亡等过程，还可通过调节肿瘤微环境促进肿瘤细胞糖酵解，同时降低其线粒体活性［9］。最近研究发现，IL-6/STAT3信号不仅对原发性肝癌有影响，其与继发性肝癌形成也有密切联系。其他部位肿瘤发生时，非恶性细胞释放IL-6，激活肝细胞中STAT3信号，促进血清淀粉样蛋白A1和A2（serum amyloid A，SAA）产生，通过形成促转移生态位导致肿瘤转移至肝脏，导致继发性肝癌［10］。

3 IL-6/STAT3信号通路在肝癌发生发展中的作用机制

3.1 对肝癌细胞增殖能力的影响STAT3可能是抑制肝癌细胞过度增殖的重要靶点，活化的IL-6/STAT3信号可通过激活增殖相关因子转录活性，促进肝癌细胞增殖。体内实验表明，肝癌组织中STAT3和p-STAT3蛋白表达明显高于癌旁组织，同时其下游增殖相关因子cyclin D1和P21表达也显著提高［11］。采用STAT3-siRNA体外转染肝癌细胞株HepG2后发现其下游分子cyclin D1表达在不同时间点均显著下调，同时细胞增殖实验结果也发现，沉默STAT3表达，各检测时间点细胞增殖率均明显下调［11］。成纤维细胞生长因子19（fibroblast growth factor 19，FGF19）是成纤维细胞生长因子家族成员，通过与成纤维细胞生长因子受体（FGFR4）结合，参与HCC发生发展，在细胞增殖和分化中起重要作用。ZHOU等［12］在对小鼠HCC的研究中发现，IL-6/STAT3信号通路在促进FGF19驱动HCC发展中发挥键作用，阻断IL-6/STAT3通路可抑制FGF19诱导的肝癌进展。组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）在调节细胞周期中起重要作用，高表达HDAC3可通过STAT3途径促进肝癌细胞增殖，沉默HDAC3可导致STAT3信号中断，显著抑制肝癌细胞增殖［13］。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）主要由胚胎期肝细胞分泌，成年后正常人体内几乎检测不到其表达，但约70%肝癌患者体内AFP含量显著升高，因此AFP目前作为特异性肝癌标志物广泛应用。AFP的生物学功能发挥可能部分通过持续激活STAT3完成。张泽亮等［14］研究发现，过表达AFP，STAT3蛋白磷酸化水平显著上调，HepG2细胞增殖能力明显提高，在细胞生长48 h后分析细胞周期发现，试验组S期细胞明显增多，提示AFP可能通过STAT3磷酸化信号促进肝癌细胞增殖。

3.2 对肝癌细胞迁移、侵袭的影响上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是细胞通过失去极性，去分化为间充质表型，导致上皮细胞可塑性改变的生物学过程。目前普遍认为EMT广泛参与肝纤维化和肝癌进程，与肝癌早期转移密切相关。EMT发生时，分子水平表现为上皮细胞分子标志物E-cadherin表达降低，间质细胞分子标志物Vimentin表达增加。刘婷等［15］在HepG2和HCCLM3细胞研究中发现，体外单纯添加IL-6可显著提高p-STAT3水平，但无法直接诱导肝癌细胞EMT。IL-6和TGF-β共同刺激时，p-STAT3、p-Smad3、Snail、Vimentin表达水平比单独刺激组显著上调，相反E-cadherin表达明显下调。提示IL-6/STAT3信号有望作为正向调节因子增强TGF-β1诱导的肝癌细胞EMT。

Twist是HCC进展中重要的EMT诱导剂，上调其表达可显著抑制E-cadherin表达，诱导细胞转移以提高肿瘤细胞恶性程度。ZHANG等［16］在人肝癌细胞株SMMC7721和MHCC97H研究中发现，过表达STAT3可显著下调E-cadherin和β-cadherin表达，同时上调Vimentin表达，而敲除实验则结果相反。进一步机制研究中，双荧光素酶报告试验结果显示，STAT3可能通过结合Twist的启动子增强Twist转录活性，促进肝癌细胞EMT。肿瘤组织中，异常的基质降解可导致肿瘤细胞无序生长，促发炎症反应，并伴随浸润和转移。基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）除可降解细胞外基质和基底膜外，还可促进肿瘤组织血管生成，与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关。祝普利等［17］研究人肝癌细胞株HepG2、HuH7、SMMC7721和MHCC97H时发现，STAT3特异性抑制剂JSI-124可显著抑制肝癌细胞p-STAT3表达，同时降低肝癌细胞侵袭能力，且呈浓度依赖性，同时发现抑制STAT3表达可降低MMP-2和MMP-9蛋白表达及活性，且呈浓度依赖性。表明STAT3信号转导通路在肝癌侵袭和转移过程中起重要作用，其作用机制可能是通过调控下游MMPs表达参与肝癌发生发展。黄芩甙是从植物黄芩中提取、分离的黄酮类化合物，近年发现其具有显著抗肿瘤作用。多项研究表明，其可明显抑制肝 癌 细 胞 增 殖 和 转 移［18］。LIU等［19］在HepG2和MHCC97H细胞系研究中发现，黄芩甙可通过重塑细胞骨架显著降低肝癌细胞侵袭能力，这一过程可能通过下调STAT3信号实现。

3.3 对肝癌细胞凋亡的影响多项研究表明，HCC发生发展不仅是细胞增殖分化失控、转移侵袭失调的结果，细胞异常凋亡也具有重要作用。在肝癌起始、促动、进展等各阶段均伴有细胞凋亡，但其具体作用尚未阐明。IL-6是一种重要的抗肿瘤凋亡诱导剂。流式双标记染色法检测发现，将STAT3-siRNA转入人正常肝细胞LO2和肝癌HepG2细胞株，24 h、48 h、72 h细胞凋亡率均显著高于同时间点的空白对照组［19］。LIU等［20］研究人肝癌细胞系SNU-499发现，IL-6可通过活化STAT3信号提高阿霉素处理后的细胞生存率，同时降低细胞凋亡率。进一步研究表明，采用STAT3 siRNA或其小分子抑制剂LLL12阻断IL-6/STAT3信号后，阿霉素处理后的肝癌细胞凋亡率明显上调，提示靶向阻断IL-6/STAT3信号通路可能通过促进肝癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。藏红花是鸢尾科番红花属的球根类花卉，作为药物、香料或染料被广泛应用，近年发现藏红花素具有良好的抗癌活性，对前列腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤有潜在治疗作用。KIM等［21］在HepG2和Hep3B细胞系研究中发现，藏红花素可通过抑制IL-6诱导的STAT3活化导致STAT3去磷酸化，下调下游抗凋亡基因Bcl-2和survivin表达，促进肝癌细胞凋亡，同时下调特异性细胞周期蛋白cyclin D1表达，抑制肝癌细胞增殖。雷洛昔芬（Raloxifene）是一种选择性雌激素受体调节剂，近年发现其对某些受体诱导的细胞凋亡具有抑制作用，有望用于肝癌治疗［22］。WANG等［23］体内实验发现，每日给予一定量雷洛昔芬可显著抑制小鼠体内HepG2肿瘤生长，机制研究发现，雷洛昔芬对IL-6刺激的STAT3磷酸化具有抑制作用，通过抑制STAT3下游促凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl及survivin表达促进肝癌细胞凋亡。此外，WEN等［24］发现，阿帕替尼（Apatinib）可抑制人肝癌SMCC7721细胞系VEGFR2/STAT3信号活化，显著下调VEGFR2和STAT3磷酸化水平，其下游BAX/Bcl-2比值升高，促进肝癌细胞凋亡，提示IL-6/STAT3信号通路可能通过Bcl家族影响细胞凋亡。细胞自噬是机体在应激条件下通过降解自身蛋白和衰老细胞器以适应外界环境变化的重要生理过程。自噬与肝癌细胞恶性生物学行为密切相关。LU等［25］研究 表明，人IL-6重 组蛋白可 诱 导HepG2细胞自噬，而沉默或采用单克隆抗体阻断IL-6表达或活性后，自噬水平明显降低。IL-6可能通过诱导自噬相关蛋白Beclin1、LC3B及NS5ATP9表达激活自噬过程。提示在肝癌发生发展中，自噬可能通过降解细胞衰老蛋白及细胞器为肿瘤细胞过度增殖提供物质保障，维持肿瘤细胞线粒体功能及能量平衡。

3.4 对血管生成的影响血管生成在肿瘤发展、转移过程中起重要作用，抑制这一过程可明显阻止肿瘤发展和扩散转移。血管生成机制复杂，现已证实血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肿瘤血管生成和肿瘤进展中扮演重要角色。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有增加血管通透性、促进细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，可通过与其受体VEGFR1和VEGFR2结合，迅速加快新生血管生长。尽管VEGF的诱导物种类丰富，但其启动子的主要转录激活子仅有HIF-1（hypoxia inducible factor-1）和STAT3，提 示HIF-1和STAT3是VEGF表达的关键调节器［26-27］。WEN等［24］研究肝癌SMCC7721细胞系时发现，其VEGF和VEGFR2表达在mRNA水平和蛋白水平均明显高于正常肝细胞。阿帕替尼是一种特异性VEGFR2抑制剂，可通过抑制p-STAT3和p-VEGFR2表达显著下调肝癌细胞存活率，并上调其细胞凋亡率。特异性阻断STAT3表达可进一步增强这一效应，提示STAT3在肿瘤细胞血管生成中具有重要作用。阿帕替尼可能通过下调p-STAT3和p-VEGFR2表达诱导其下游Bax/Bcl-2比值升高，进而促进细胞凋亡。田爱平［3］研究发现，小鼠慢性诱导性肝癌组织中IL-6、STAT3与VEGF、VEGFR2及CD31等相关血管内皮生长因子蛋白表达明显高于癌旁组织，且表达水平呈正相关。而采用质粒转染过表达IL-6，血管再生相关因子分子及蛋白水平表达也显著提升，细胞增殖能力明显增强，提示IL-6在肝癌患者肿瘤血管再生中具有重要调控作用。此外，XU等［27］证实STAT3是抑制肿瘤VEGF表达和血管生成的有效靶点，包括IL-6R、c-Src、her2/neu等多种诱导子激活的VEGF表达均在靶向阻断STAT3信号的细胞中减弱。体外实验结果显示，采用小分子抑制剂靶向抑制STAT3将明显下调HIF-1和VEGF表达，肿瘤细胞体内血管生成能力减弱，这一过程可能通过同时影响JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路完成。证明STAT3可能是抑制肿瘤血管再生相关因子表达、影响血管生成的有效靶点。

4 针对IL-6/STAT3信号的肝癌靶向治疗

HCC患者5年生存率仅为10%，其中手术患者的5年生存率可达40%～80%，但多数患者就诊时已属晚期，失去了手术机会［28］。因此，提高药物治疗的有效性是延长患者生存期限的关键。HCC发生发展因素复杂，涉及炎症、死亡、新生血管及基因突变等多个领域，因此寻找潜在治疗靶点是当前临床研究热点。

4.1 直接靶向IL-6/STAT3信号治疗肝癌的策略

近年来，HCC治疗药物发展迅速，尤其是以免疫检查点抑制剂为主的分子靶向药物被先后用于临床，疗效和安全性等较好。但最近临床试验显示，免疫检查点抑制剂单药对肝癌的治疗效果有限，联合用药效果更佳。LIU等［4］研究IL-6在肝癌模型中的免疫调节作用，证实IL-6阻断可增强HCC患者抗肿瘤免疫，与抗程序性死亡-1-配体1（PD-L1）检查点抑制剂协同治疗HCC可在一定程度上逆转HCC对PD-L1抗体的耐药性。高表达IL-6可通过上调抑制性免疫检查点影响肿瘤浸润性T细胞功能，表明靶向抑制IL-6可提高HCC抗PD-L1疗效，为HCC分子靶向治疗提供策略。徐倩［5］采用新型IL-6单克隆抗体HC6R1处理肝癌细胞系HepG2和Huh7发现，HC6R1可显著抑制肝癌细胞增殖、迁移、黏附和侵袭，体内实验结果表明，HC6R1可抑制小鼠肿瘤生长，并延长原位成瘤小鼠生存时间，其机制可能是通过抑制STAT3活化从而将细胞阻滞在G1/S期，抑制肿瘤细胞增殖的同时促进细胞凋亡。近年细胞膜受体gp130与肿瘤增殖、转移和凋亡等的关系备受关注，汤嵩［29］研究发现，gp130在人肝癌细胞中呈高表达，采用具有口服活性的gp130小分子抑制剂SC144处理肝癌细胞株后，可有效促进肝癌细胞凋亡，并具有一定抑制肿瘤增殖作用。提示gp130可能是肝癌治疗的另一重要靶点。当前，全细胞肿瘤疫苗已在癌症防治中表现出巨大潜力，HAN等［30］研究肝癌细胞系H22和Hepa1-6时发现，STAT3阻断全肝癌细胞裂解物可抑制肿瘤发生和生长，延长荷瘤小鼠存活时间，同时刺激免疫T细胞及NK细胞活化，增强CD8+T细胞在肿瘤组织中的浸润，增强细胞毒性，此外，树突状细胞成熟度提高，促进肝癌免疫记忆产生，当免疫小鼠被HCC细胞攻击时，随T细胞和NK细胞激活和浸润，可引发继发性免疫反应。STAT3阻断的全肝癌细胞裂解物可阻止HCC介导的T细胞和NK细胞衰竭，表明免疫小鼠T细胞和NK细胞上的PD-1和TIGIT等免疫检查点分子呈低表达，表明STAT3阻断的全细胞肝癌疫苗具有肿瘤细胞免疫的潜力。

4.2 针对miRNAs靶向IL-6/STAT3信号治疗肝癌的策略miRNAs为非编码小分子RNA，在血管生成、细胞增殖、存活和分化等多个生理过程中起重要作用［31］。研究认为，miRNAs在人类恶性肿瘤发展中作为肿瘤抑制因子发挥作用［32］。目前开发的药物多数靶向单个位点，而miRNAs可靶向多个位点，因此其在肝癌治疗方面具有巨大潜力。

HCC中miR-124表达显著下调，过表达miR-124可促进HCC细胞凋亡并抑制其增殖。LU等［33］机制研究发现，miR-124可通过直接结合STAT3 3'UTR区抑制STAT3和p-STAT3蛋白表达，转染miR-124的HepG2细胞中过表达STAT3可有效消除miR-124对细胞增殖抑制作用。提示miR-124可通过靶向STAT3发挥肿瘤抑制作用，有望成为肝癌诊断、治疗的生物标志物。

miR-197也被认为是潜在的癌症诊断分子标志物，其表达水平与HCC患者生存期呈显著正相关。WANG等［34］采用体外合成的胆固醇修饰的miR-197类似物治疗肝癌荷瘤小鼠，发现其可明显抑制肿瘤生长，减小肿瘤体积，表明miR-197有望用于肝癌治疗。肝癌组织芯片分析发现，miR-197与IL-6、STAT3蛋白水平呈负相关，体外实验结果显示，过表达miR-197在促进细胞凋亡的同时，可通过将细胞阻滞在G1期从而抑制其增殖，同时将miR-197及STAT3过表达载体转入肝癌细胞将显著逆转这一现象，表明miR-197可能作为潜在的治疗靶点干预IL-6/STAT3信号通路在肝癌发生发展中的作用［34］。

裸鼠肝癌模型研究发现，过表达miR-345对肿瘤生长及肺转移具有抑制作用，进一步机制研究显示，体外过表达miR-345可显著抑制STAT3及AKT蛋白表达，同时E-cadherin蛋白表达明显增高，Claudin-1、N-cadherin及Snail蛋白表达降低，提示EMT过程被抑制［35］。雷帕霉素作为STAT3通路阻断剂，已被证明可有效抑制肝癌细胞侵袭和转移。YU等［35］研究发现，雷帕霉素可降低EMT发生频率，提示STAT3/AKT信号可能作为EMT上游因子发挥正向调节作用。表明miR-345可显著调节肿瘤微环境，其机制可能是通过靶向STAT3/AKT信号抑制EMT，阻止肝癌细胞侵袭和转移。

肝癌miRNAs表达谱中也发现miR-26表达下调［36］。多项研究表明，IL-6 3'UTR区同时具有miR-26a和miR-26b的结合位点［37-38］。体外实验结果显示，转染miR-26b后HepG2细胞IL-6、p-STAT3蛋白表达被显著抑制，同时自噬相关蛋白Beclin1表达下调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调，提示自噬发生，沉默IL-6表达，自噬水平上调［38］。证实miR-26b通过靶向抑制IL-6/STAT3信号通路激活诱导肝癌细胞自噬，为肝癌诊治提供新的靶点。miR-26a也被证实与HCC转移和复发呈负相关［36］。YANG等［36］研究发现，过表达miR-26a显著抑制IL-6表达，同时STAT3下游靶基因，包括Bcl-2、Mcl-1、cyclin D1及MMP2表达明显下调，提示细胞凋亡过程被促进而增殖过程被抑制，过表达IL-6可拮抗这一作用。提示IL-6是miR-26a调节HCC微环境的功能靶分子，miR-26a可通过抑制IL-6/STAT3信号通路发挥对HCC的抑制作用。临床试验结果表明，miR-26a和IL-6联用对HCC预后的预测效果最好，优于miR-26a或IL-6独立预测［36］。

此外，研究发现，与癌旁组织相比，miR-125b及miR-543在HCC中表达显著降低，肿瘤组织中高表达miR-125b或miR-543的HCC患者术后生存率更高，肿瘤复发率更低［39-40］。靶向抑制miR-543表达可显著提高肝癌细胞增殖率，同时降低其凋亡率，可能通过降低p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和Bcl-2表达完成。IL-6R和STAT3 3'UTR区均具有miR-125b的结合位点［37］。JIA等［39］体外研究发现，过表达miR-125b可通过直接靶向调节IL-6R和Mcl-1抑制细胞增殖和细胞周期循环，提示miR-125b可能在HCC发生发展中发挥关键抑癌基因作用，进一步研究其功能可能为HCC治疗提供新靶点。

5 结语

体内细胞因子网络是一个复杂的体系，炎症因子异常表达在HCC发生发展中扮演重要角色。IL-6、STAT3、p-STAT3异常表达可通过影响肝癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡和血管生成等方式促进肿瘤进展。采用IL-6单克隆抗体、gp130抑制剂、STAT3沉默及靶向miRNAs等方式阻断该信号通路在抗肝癌治疗中疗效较好。未来对该方向的深入研究将有助于HCC的靶向治疗研究，为新的靶向药物研发，并通过靶向干预与其他药物联用改善临床治疗效果提供新的思路。