二维反相色谱法测定婴幼儿米粉中维生素A、D和E

龚树斌

（1.福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）

婴幼儿米粉容易消化吸收，营养丰富，非常适合婴幼儿食用，但是近五年食品抽检中婴幼儿米粉不合格数量达200多批次，不合格项目中营养成分不合格占比高达80%，其中维生素A、D和E均出现多次不合格，所以维生素含量测定显得尤其重要。维生素测定方式比较常见的方式有： 分光光度法[1]、层析法[2]、液相色谱法[3-6]等，而主要方法是液相色谱法。但是，现行的国标检测方法提取方法繁琐，不稳定，耗时，由于维生素D含量较低，易受基质干扰[7]，且国标方法使用两次提取法测定维生素含量A、D和E时，需要同时使用正相和反相仪器。本研究经查阅参考文献和相关资料，优化方法，仅使用一次前处理和一台二维反相仪器建立了一种更高效率测定婴幼儿米粉中维生素A、D和E含量的方法。

二维反相色谱通过切换一维和二维的2个六通阀来达到维生素A、D和E的分离。阀连接示意图见图1。

图1 二维阀连接示意图

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

维生素A（视黄醇纯度99.3%）、维生素D（维生素D2，纯度99.6%）和维生素D3（纯度99.9%）、维生素E（α-生育酚纯度96.9%），德国Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇和乙腈为色谱纯；

抗坏血酸、BHT、无水乙醇、石油醚、正己烷、无水硫酸钠、氢氧化钾：分析纯，广西西陇科学股份有限公司。

Waters ACQUITY Arc 2D（搭配250μL注射器及定量环），Waters光电二极管阵列检测器（PAD2998）和自动进样器。C18色谱柱（5μm，4.6×250 mm）、Poroshell 120PFPC18 色谱柱（4.6×100 mm，2.7μm）和XselectHSS SB色谱柱（C18柱）（3.0×150 mm，3.5μm）；IKA MS 3 basic单发涡旋振荡器，上海沪粤明科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

精确称取标准品维生素A、D2、D3和E至棕色容量瓶中，0.1% BHT的乙醇定容；量取适量该标准储备液配制成混合标准储备溶液，维生素A、D2、D3和E标准样品的浓度分别为24.3、1.70、1.78、211 μg/mL，见表1。吸取上述维生素A、D2、D3和E混合标准储备溶液稀释，绘制标准工作曲线，见表2。

表1 维生素A、D2、D3和E的标准溶液配制表

表2 维生素A、D2、D3和E的标准曲线配制

1.2.2 样品前处理

精确称取米粉2 g于250 mL棕色三角瓶中，加入0.5 g淀粉酶，15 mL热水，恒温烘箱60 ℃酶解20 min后，依次加入1 g抗坏血酸，0.1 gBHT，20 mL无水乙醇和10 mL 500 g/L的KOH溶液，烘箱80 ℃皂化20 min后，转移至500 mL棕色分液漏斗，皂化液以55 mL石油醚提取2次，合并提取液，加入5 mL0.3%冰乙酸溶液，水洗至pH中性，经过无水Na2SO4脱水收集上层石油醚。旋转蒸发仪回收石油醚，近干后以5 mL甲醇定容，上机分析。

1.2.3 色谱条件

一维色谱条件：采用Poroshell 120 PFP色谱柱（4.6×100 mm，2.7μm），1.0 mL/min，柱温为 35 ℃。

二维色谱条件：采用Xselect HSS C18SB色谱柱（3.0×150 mm，3.5μm），采用0.5 mL/min，采用柱温为40 ℃。

捕集柱：采用XBridge BEH C18 Direct Connect HP（2.1×30 mm,10μm）检测器： 2998PAD Detector检测波长：VA：λ=325 nm、VD2、VD3：λ=264 nm、VE：λ=294 nm。

流动相：A-纯水；B-乙腈；C-甲醇，进样量：均为10 μL，梯度洗脱条件见表3。

表3 梯度洗脱条件

2 结果

2.1 色谱条件的选择

对D2和D3进行完全分离是需要解决的关键问题之一，本研究二维色谱柱尝试用酰氨基柱和Xselect HSS C18SB色谱柱进行分离，并作条件优化，对比结果发现使用Xselect HSS C18SB色谱柱（3.0×150 mm，3.5μm）能很好地分离D2和D3，分离度更好且峰形较好，杂峰更少。

2.2 柱温的选择

方法对柱温进行了优化，对比结果发现二维的柱温在40 ℃时与35℃时分辨率相似，但40 ℃时加快D2和D3的分离过程，缩短检测时间。在本方法的色谱条件下维生素A、D2、D3和E的混合标准溶液色谱图见图2。

图2 维生素A、D2、D3和E对应波长下的标准溶液色谱图

2.3 前处理条件的优化

对比水浴锅和烘箱作为供温设备处理婴幼儿米粉时，维生素A、D2、D3和E含量的测定结果相差不大。但相同条件下，烘箱处理样品量远大于水浴锅，所以本文选用烘箱作为供温设备提供酶解和皂化。

实验表明，在氢氧化钾添加量10 mL，皂化温度80 ℃，皂化时间20 min 时，提取效果比较理想。如果皂化温度过高或时间过长，则易导致维生素A、D2、D3和E目标物损失；而皂化温度过低、氢氧化钾添加量过少或皂化时间过短，则皂化不完全。

对比正己烷、石油醚、石油醚+乙醚（1+1）和乙醚4种提取溶剂，发现其对维生素A、D2、D3和E结果的影响不大；使用纯乙醚作为提取溶剂时，易出现乳化现象，且乙醚毒性高，长期使用对人体健康产生影响，所以排除石油醚+乙醚（1+1）和纯乙醚作为提取溶剂，而正己烷价格较石油醚昂贵许多，因此本文选用石油醚作为提取溶剂。

2.4 方法的评价

2.4.1 方法的线性关系和检出限

根据配制的混合标准系列溶液，从低浓度到高浓度依次进样，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。各标准样品在不同浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数均在0.9998以上。得到线性范围和线性方程后，将该标液稀释至以信噪比（S/N）约等于3时的浓度作为检出限，将该标液稀释至以信噪比（S/N）约等于10时的浓度作为定量限，测定结果见表4。

表4 方法线性关系结果表

2.4.2 回收率和精密度

挑选一款含有较低维生素水平的婴幼儿米粉作为基质，添加维生素A、D2、D3和E混标，每个浓度平行测定6次，并进行3水平加标回收试验，见表5。结果表明，维生素A、D2、D3和E的加标回收率在91.9%～100.4%之间，RSD在1.8%～4.9%之间，说明本方法准确度和精密度均较为理想，满足分析的要求。

表5 方法的加标回收率和精密度（n=6）

2.5 实际样品分析

选择10种不同品牌的婴幼儿米粉进行方法可行性验证，利用本方法与国标GB 5009.82—2016方法进行结果对比，验证本方法。采用国标方法和本方法分别对同一样品测定6次。其中VD2均未检出，故本文VD仅代表VD3。

经过t检验的处理，各个t值如下（见表6），均小于通过查t检验表得到的t值2.228，所以p值均大于0.05（双侧检验）。因此本文方法的测定结果与国标方法无显著性差异，可以满足对实际样品的检测。

表6 实际样品测定结果

3 结论

本文对二维反相色谱法检测婴幼儿米粉中维生素A、D和E含量方法的前处理条件和仪器方法进行了优化，与国标GB 5009.82—2016方法相比，具有快速、简单、重现性好、灵敏度高的优点，解决了婴幼儿米粉中维生素A、D和E含量的测定步骤繁琐的问题，降低了实验成本，节省了时间，具有一定的实际应用价值。