5株凝结芽孢杆菌的鉴定及抗逆性分析

陈秀秀，孙洪浩，孙小涵，吕福军

(辽宁波尔莱特农牧实业有限公司，辽宁 沈阳 110000)

随着2019年禁抗令的颁布，饲料市场引起轩然大波，在动物疫病错综复杂，尤其是非洲猪瘟常态化的背景下，如何平稳地过渡到“无抗时代”，已成为畜牧全行业关注的焦点与挑战。以生物技术为主导的畜牧生物产业正加速形成，并推动畜牧业高效快速的发展。微生物饲料添加剂被认为是抗生素的潜力替代物之一，具备改善生长性能、调节免疫反应和平衡肠道微生物菌群等作用。乳酸菌作为益生菌株应用于畜禽养殖历史悠久，其中应用较多的为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌和双岐杆菌等。酵母菌类因其可以产香的特点进而增加适口性，但此类制剂抗逆能力差，活菌存活率低，影响其饲喂效果。芽孢杆菌类益生菌因芽孢抗逆性强，可以直接添加至配合饲料中。因此，开发抗逆性强且对动物健康有益的菌种成为全国高度关注的重大课题。

凝结芽孢杆菌( Bacillus coagulans )为革兰氏阳性兼性厌氧菌，非致病菌，产芽孢产乳酸的杆菌，端生芽孢，能够分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇等多种糖类产生L-乳酸，为同型乳酸发酵菌，最适生长温度为40～50 ℃，最适生长pH 为6.6～7.0。凝结芽孢杆菌除具备普通乳酸菌的调节肠道内菌群平衡、促进营养物质代谢和提高免疫力的作用外，还具有耐胆盐、耐胃肠消化液、热稳定性等生物特性。本研究对5个凝结芽孢杆菌产品的抑菌性、耐消化液能力、耐胆盐能力和热稳定性进行评价，旨在为其饲料生产实践筛选优良产品，为凝结芽孢杆菌作为饲用添加剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

凝结芽孢杆菌均购自国内不同厂家，分别命名为A、B、C、D、E；金黄色葡萄球菌(SA)、大肠埃希氏菌(K88)由本实验室保存；MRS培养基、MRS肉汤、营养琼脂、营养肉汤均购自北京陆桥技术股份有限公司；生化鉴定所用试剂购自青岛海博生物科技有限公司；人工胃液和人工肠液购自北京雷根生物技术有限公司。

1.2 菌株分离鉴定

精确称量1.000 g待测菌粉，置于100 mL稀释液中， 37 ℃ 200 r/min充分振荡30 min，； 80 ℃水浴20 min，梯度稀释，MRS培养基倾注平板37 ℃培养48 h。挑取单菌落进行3次平板划线纯化菌株。

1.3 菌株生化鉴定

1.3.1 形态学观察 取疑似单菌落进行革兰氏染色、芽孢染色，观察细菌形态及芽孢形成状态。

1.3.2 生化鉴定 根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》，对5株菌进行吲哚试验、55 ℃生长、7%氯化钠生长、柠檬酸盐利用、V-P试验、明胶液化、硝酸盐还原、酪氨酸水解、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇发酵和溶菌酶生长等生化试验。

1.4 总菌数测定

精确称量1.0 g待测菌粉，置于100 mL稀释液中， 37 ℃ 200 r/min振荡30 min；再10倍逐级稀释至所需稀释度，MRS培养基倾注培养，37℃培养箱内厌氧培养48 h后计数。

1.5 热稳定性试验

取4个重复中的2个1 mL 10-2菌粉稀释液作为实验组，65 ℃、85 ℃、100 ℃水浴30 min，另外2个作为对照组不做处理。MRS培养基倾注培养，37 ℃培养48 h后计数，选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，对照组不做处理，存活率计算公式如下：

存活率(%)=热处理活菌数/对照组活菌数×100%

1.6 抑菌性试验

精确称量0.003 g(按30 g/t添加量)待测菌粉，置于100 mL MRS液体培养基中， 37 ℃ 200 r/min充分振荡48 h，12 000 r/min离心5 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤备用。取活化后的指示菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌适量于LB液体培养基中，调整其吸光值约为0.05，测定600 nm处吸光度。实验组为4 mL指示菌液加1 mL实验菌液，对照组为4 mL指示菌液加1 mL生理盐水。37 ℃ 200 r/min充分振荡共培养3 h，测定600 nm处吸光度值，计算抑菌率。

抑菌率(%)=[(A空-A空0)-(A样-A样0)]/(A空-A空0)×100%

1.7 人工胃肠液耐受性试验

精确称量1.0 g待测菌粉加入pH 2.0人工胃液，37 ℃静置培养4 h后，MRS培养基倾注培养。精确称量1.000 g待测菌粉加入pH 7.6人工结肠液，37 ℃静置培养12 h后，MRS培养基倾注培养，对照组为生理盐水。

存活率(%)=胃肠液处理活菌数/对照组活菌数×100%

1.8 耐胆盐试验

取1 mL 10-2菌粉稀释液，加入9 mL含有0.03%、0.1%、0.3%、0.5%、1%胆盐浓度的MRS肉汤培养液中，对照组不做处理，37 ℃静置培养24 h后， MRS培养基倾注培养， 37 ℃培养48 h后计数，选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，计算存活率。

存活率(%)=胆盐组处理活菌数/对照组活菌数×100%

1.9 数据分析

所有数据均用统计软件SPSS 17.0进行统计学处理，数据均以平均值±标准差表示，参数组间比较采用 t 检验。

2 结果

2.1 分离菌株形态

A、D、E菌落为白色，呈圆形且边缘整齐；B菌落灰白色，圆形，边缘不整齐、中心突起且有光泽； C菌落扁平，呈白色，圆形，边缘整齐且中心无凸起。5个菌株均为革兰氏阳性，菌体呈杆状，芽孢端生，单个或成对，少数呈短链状。

2.2 生理生化鉴定

由表1可知，菌株明胶液化阴性，V-P反应为阳性，55 ℃ 生长为阳性，吲哚试验为阴性，7% 氯化钠生长为阳性，溶菌酶生长为阴性，其他结果详见表1。上述结果与《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》中关于凝结芽孢杆菌的分析进行比较，初步鉴定为凝结芽孢杆菌。

表1 各菌株生理生化特征

2.3 总菌数测定结果

为了考察不同厂家的凝结芽孢杆菌产品的菌量与所标注的是否一致，评价了5株凝结芽孢杆菌的总菌数，结果见表2。由表2可知，A、B、D、E的菌量均超出目标菌量，符合标准，而C的实际菌量比目标菌量少50亿，E的实际菌量比目标菌量大约少一个数量级。

表2 各菌株的目标菌数测定

2.4 热稳定性试验

饲料生产过程中的某些环节如热处理、制粒和膨化环节均需要高温处理，温度范围一般在65～120 ℃之间，因此选择65 ℃、85 ℃、100 ℃作为试验温度处理30 min，研究高温对5株凝结芽孢杆菌存活率的影响。由图1 可知，5株均完全耐受65 ℃，存活率均在100%左右；85 ℃处理后仅A株可达到100%，其余4株菌均有所下降；至100 ℃水浴30 min后，A株仍可达62%，具有良好的热稳定性。

图1 不同温度对凝结芽孢杆菌存活率的影响

2.5 抑菌性

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为指示菌，比较5株凝结芽孢杆菌的抑菌活性，筛选出效果优的产品应用于临床生产。根据表3结果显示，A株对共培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制活性优于其他菌株，抑菌率分别是101.4%和99.8%，抑制大肠杆菌活性显著高于B株(P<0.05)和E株(P<0.05)，同时也显著高于D株(P<0.01)，抑制金黄色葡萄球菌活性显著高于B株(P<0.05)和D株(P<0.05)，同时也显著高于E株(P<0.01)。

表3 各菌株对指示菌的抑菌活性

同列无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，P<0.05和P<0.01是与A组相比。

2.6 人工胃肠液耐受性试验

通常猪的胃酸pH值在2.0-3.0，进食后由于食物的中和作用pH可达5.0以上，流体食物在胃中停留时间为1-2 h，随后进入小肠中，因此对人工胃肠液耐受性决定了益生菌在胃肠道中所能发挥的益生作用。根据表3的结果可知，A和C有较好的胃酸耐受性，在pH2.0的强酸条件下，存活率仍在50%以上。A株完全耐受人工肠液，存活率为100%，优于其他组凝结芽孢杆菌，其次是B株，存活率为95%。

2.7 耐胆盐试验

猪小肠正常胆盐浓度范围是0.03%～0.3%，选择0.03%、0.10%、0.30%、0.50%和1.00%5个胆盐浓度，比较不同凝结芽孢杆菌产品的耐胆盐能力。图2结果表明，A株和B株最大耐受胆盐浓度为1%，存活率可达100%以上，在小肠环境中可以正常生长；其余三组都受到胆盐的抑制作用，胆盐浓度达到0.50%时，存活率明显下降约20%～30%。

表4 人工胃肠液对凝结芽孢杆菌存活率的影响

图2 不同胆盐浓度对凝结芽孢杆菌存活率的影响

3 讨论

凝结芽孢杆菌作为可以形成芽孢的益生乳酸菌，既具有芽孢杆菌的特点，同时还具有乳酸菌的优势。研究表明凝结芽孢杆菌具有多种生物特性，例如抗菌、抗炎、调节肠道菌群平衡、改善机体免疫功能、促进消化吸收和改善仔猪腹泻等。Sudha 等证实凝结芽孢杆菌IS2可以抑制炎症因子IL-12、TN-α 和IFN-γ的表达，还能抑制环氧化酶COX-2的生成，从而抑制NF-κB P65 蛋白(Rel A)的表达。大量研究表明，凝结芽孢杆菌在肠道内生长代谢会分泌多种有益物质，如脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、木聚糖酶、凝固素和Lactosporin等，这些酶类可以降解蛋白质、淀粉等大分子，增强肠道代谢率，进而提高饲料的利用率；多肽类抑菌物质凝固素是由 44 个氨基酸组成，呈现为一个α-螺旋连接两个无规则卷曲的线性结构，能不受细胞膜限制而自由穿越，且不受淀粉酶、脂酶和有机溶剂的影响。细菌素Lactosporin可穿透致病菌表面，导致细胞内的氨基酸、无机盐离子泄露，从而起到抑制病原菌的作用 。

凝结芽孢杆菌作为益生菌领域的研究热点，除具有以上生物特性外，还具有耐热和耐胆盐等高抗逆性。本研究比较5个不同厂家的凝结芽孢杆菌产品的一些生理特性，通过对5株凝结芽孢杆菌的研究，结果显示A和B菌株具有较好的高温耐受性，在85 ℃条件下作用30 min，存活率可达到90%以上；菌种对细菌具备一定的抑菌能力，抑菌活性从高到低排序依次为A、C、D、E、B；A和C菌株具有较好的酸耐受性，用pH2.0人工胃液处理4 h，菌种存活率能达到50.0% 以上；5个菌株均可以耐受0.3%胆盐，可以在小肠环境中正常生长。因此，可选择抗逆性能最好的A株凝结芽孢杆菌作为备选饲料添加剂。随着对凝结芽孢杆菌的进一步研究，凝结芽孢杆菌因其自身的特点和优势，在饲料微生态制剂中发展应用潜力巨大，前景广阔。今后将对凝结芽孢杆菌的益生性能做进一步的研究。