HPLC法同时测定清肺排毒汤冻干物中2种黄酮类成分的含量

吴远波 焦 涛

1.江西省医学科学院，江西 南昌 330006；2. 辽宁省丹东市市场监管事务服务中心药检部，辽宁 丹东 118002

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)自发生以来，由于其潜伏周期长、传染性强、致病力强等特点[1]，在全国快速蔓延，给我国人民群众的生命财产带来巨大的损害。在新冠肺炎疫情早期没有特效药和疫苗的情况下，广大中医药工作者认真总结中医药治疗病毒性传染病的规律和经验，筛选有效方剂，促进中医药深度介入新冠肺炎诊疗全过程[2]。国家中医药管理局组织实施应急科研专项，在河北、山西、黑龙江、陕西四省开展试点临床观察，结果显示清肺排毒汤治疗新型冠状病毒感染的肺炎患者总有效率可达90%以上[3]。在此基础上，国家卫生健康委员会和国家中医药管理局在2020年2月通知，推荐各地在新型冠状病毒感染肺炎治疗时使用清肺排毒汤[4]。在随后的新冠肺炎诊疗中，清肺排毒汤被广泛使用，有效减缓病情发展，临床疗效明显[5-8]。

鉴于清肺排毒汤在抗疫工作中展示的确切疗效和重大研究成果，及其在今后常态化防疫工作中的潜在作用，研制可工业化生产、质量稳定可控、使用方便的清肺排毒汤成方制剂将非常迫切。药品质量研究是药品研发工作的基础和前提，对中药成方中有效成分的含量控制是对成方质量控制的重要手段。清肺排毒汤出自《伤寒杂病论》中几个经典方剂，该药处方由21味中药组成，化学成分复杂，周严严等[9]基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术，鉴定推断了清肺排毒汤中的87 个化合物，含43 个黄酮，9 个生物碱等，认为黄酮类和生物碱化合物是清肺排毒汤中的主要化合物。而橙皮苷和黄芩苷是清肺排毒汤药味中含量较高的两种黄酮类成分[10]，因此对橙皮苷和黄芩苷两种黄酮类成分进行含量控制研究具有重要意义。查阅文献发现橙皮苷和黄芩苷可以在同一条件下被检识[11-12]。本研究通过方法学验证，建立用HPLC法同时测定清肺排毒汤冻干物中橙皮苷和黄芩苷2种黄酮类成分含量的方法，实验结果表明该方法简便、准确可靠，可为清肺排毒汤成方制剂的开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色谱仪(ThermoFisher公司，包括四元梯度泵，WPS-3000SL自动进样器，TCC-3000RS柱温箱，DAD-3000检测器)；LGJ-10冷冻干燥机(四环福瑞科仪科技发展(北京)有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)； EX125ZH电子天平(奥豪斯仪器有限公司，感量0.01 mg)；FR124CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司，感量0.1 mg)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 橙皮苷对照品(批号：110721-201818，含量以96.2%计)，购自中国食品药品检定研究院，黄芩苷对照品(批号：wkq20010908，含量以98.7%计)，购自四川省维克奇生物科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，磷酸、甲醇等其他试剂均为分析纯。

中药饮片如下：麻黄饮片(批号：200601)、炙甘草饮片(批号：200601)、苦杏仁饮片(批号：200601)、生石膏饮片(批号：200501)、桂枝饮片(批号：200601)、泽泻饮片(批号：200601)、猪苓饮片(批号：200601)、白术饮片(批号：200601)、茯苓饮片(批号：200601)、柴胡饮片(批号：200701)、黄芩饮片(批号：200701)、姜半夏饮片(批号：200601)、生姜饮片(批号：200801)、紫菀饮片(批号：200601)、款冬花饮片(批号：200601)、射干饮片(批号：200601)、细辛饮片(批号：200601)、山药饮片(批号：200601)、陈皮饮片(批号：200601)、广藿香饮片(批号：200801)均购于江西汇仁堂药品连锁有限公司；枳实饮片(批号：200101)购于康美药业股份有限公司。所有饮片均由丹东市市场监管事务服务中心王铁军主任中药师鉴定。

2 方法和结果

2.1 冻干物的制备 按清肺排毒汤处方：麻黄9 g，炙甘草6 g，苦杏仁9 g，生石膏30 g，桂枝9 g，泽泻9 g，猪苓9 g，白术9 g，茯苓15 g，柴胡16 g，黄芩6 g，姜半夏9 g，生姜9 g，紫菀9 g，款冬花9 g，射干9 g，细辛6 g，山药12 g，枳实6 g，陈皮6 g，广藿香9 g[4]。称取各饮片(共计211 g)，生石膏饮片加水240 mL先煎15 min，其余20 味加8 倍量水浸泡30 min，待生石膏煎煮好后，加入浸泡好的各饮片，煎煮30 min，用200 目不锈钢筛网滤过，饮片再进行第2 次煎煮，加6 倍量水，煎煮30 min，用200 目不锈钢筛网滤过，合并2 次的药液。将药液采用减压浓缩的方法进行低温浓缩，控制浓缩温度不超过50 ℃，将水煎滤液体积浓缩至约400 mL。采用冷冻干燥的办法进行干燥，将浓缩液至放置到冷冻干燥机的干燥盘中，再放置到冷冻干燥机上进行冷冻干燥，得到清肺排毒汤冻干物。

重复上述的操作方法，共制备3批清肺排毒汤冻干物，批号分别编为2008001、2008002、2008003，质量分别为41.68 g、42.07 g、41.71 g。

除黄芩外，按清肺排毒汤处方，称取麻黄等20 味饮片，按上述制备方法制备，得到缺黄芩的阴性冻干物；除枳实和陈皮外，按清肺排毒汤处方，称取麻黄等19 味饮片，按上述制备方法制备，得到缺枳实和陈皮的阴性冻干物。

2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(20：80)，检测波长为283 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取橙皮苷、黄芩苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并制成含橙皮苷47.64 μg·mL-1、黄芩苷121.27 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取清肺排毒汤冻干物约0.5 g，置碾钵中研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，将锥形瓶密塞，称定重量，超声处理(功率500 W，频率40 KHz)45 min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.3 阴性样品溶液的制备 取缺黄芩的阴性冻干物，按2.3.2项下供试品溶液制备项下的方法进行制备操作，制得缺黄芩的阴性样品溶液；取缺枳实和陈皮的阴性冻干物，按2.3.2项下供试品溶液制备项下的方法进行制备操作，制得缺枳实和陈皮的阴性样品溶液。

1.橙皮苷；2.黄芩苷A.对照品;B.供试品;C.缺黄芩阴性样品;D.缺枳实和陈皮阴性样品图1 HPLC图

2.4 系统适用性试验 按2.2项下的色谱条件，分别取对照溶液、供试品溶液、缺黄芩的阴性样品溶液、以及缺枳实和陈皮的阴性样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图中，橙皮苷和黄芩苷2种成分与相邻的色谱峰之间的分离度均大于1.5。理论塔板数按橙皮苷峰计算不低于5000。缺黄芩的阴性样品、缺枳实和陈皮的阴性样品对待测成分的测定均无干扰。如图1所示。

2.5 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、3、5、8、10、20 μL按2.2项下色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录橙皮苷和黄芩苷的峰面积，分别以对照品的进样量(X，μg)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得到线性回归方程：橙皮苷Y=25.9060X+0.5677(r=0.9993)、黄芩苷Y=49.1870X+0.0170(r=0.9994)。结果表明，橙皮苷的进样量在0.04764～0.9528 μg，黄芩苷的进样量在0.1213～2.425 μg范围内与峰面积均有良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取2.3.1项下混合对照品溶液10 μL，按2.2项下的色谱条件，连续进行6 次的进样测定，记录橙皮苷和黄芩苷的峰面积。按峰面积计算，橙皮苷的RSD为0.4%，黄芩苷峰的RSD为0.7%，结果表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批次的清肺排毒汤冻干物样品(批号：2008003)，按2.3.2项下的方法制备供试品溶液6 份，按2.2项下色谱条件进行测定，记录橙皮苷和黄芩苷的峰面积，分别计算两待测目标成分含量。结果橙皮苷和黄芩苷的平均含量分别为3.776 mg·g-1、12.67 mg·g-1，橙皮苷的RSD为1.0%，黄芩苷的RSD为1.0%，表明该含量测定方法的重复性良好。

2.8 稳定性试验 取清肺排毒汤冻干物同一份供试品溶液(临用新配)，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h，按2.2项下色谱条件进行测定，记录橙皮苷和黄芩苷的峰面积，根据峰面积考察样品溶液的稳定性。计算得橙皮苷峰面积的RSD为1.0%，黄芩苷峰面积的RSD为0.7%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验 取同一批次已知含量的清肺排毒汤冻干物样品(批号：2008003)适量，研细，取6 份，每份约0.25 g，精密称定，根据清肺排毒汤冻干物样品中橙皮苷和黄芩苷的含量按1∶1的比例添加橙皮苷和黄芩苷对照品，按2.3.2项下的方法进行制备操作，按2.2项下的色谱条件进行测定，计算两待测成分的加样回收率，结果见表1。结果表明本含量测定方法具有良好的回收率。

表1 清肺排毒汤冻干物加样回收率试验结果 (n=6)

2.10 样品含量测定 取清肺排毒汤冻干物3批样品适量，置碾钵中研细，取约0.5 g，精密称定，按2.3.2项下的方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进行测定，记录橙皮苷和黄芩苷的峰面积，分别计算两待测目标成分含量，结果见表2。

表2 3批清肺排毒汤冻干物样品含量测定结果

3 讨论

3.1 冻干物的制备 清肺排毒汤为传统汤剂，但水煎液体积大、有效成分浓度低、不易保存，且多为悬浊液，难以保证均匀取样，不利于开展实验。将水煎液适当低温减压浓缩，再通过冷冻干燥方法，将清肺排毒汤浸膏制成质量稳定、均一、易于溶解且无辅料添加的冻干物，且可使清肺排毒汤有效成分的分解和损失最小，从而提高后续研究的效率和质量，为清肺排毒汤成方制剂的开发提供借鉴。

3.2 检测波长的选择 在190～400 nm范围对橙皮苷和黄芩苷进行紫外扫描，得到橙皮苷的最大吸收波长为283 nm，黄芩苷的最大吸收波长为277 nm。样品中橙皮苷的含量相对低，为了提高对橙皮苷的检测灵敏度，实验选用283 nm作为检测波长。在该波长下，2种黄酮类成分色谱峰形较好，检测灵敏度均能达到测定要求。

3.3 提取条件考察 在固定超声提取60 min的条件下，对提取溶剂进行比对，分别采用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇作为提取溶剂，以清肺排毒汤冻干物中橙皮苷、黄芩苷的综合提取率为指标，结果以70%甲醇作为提取溶剂对橙皮苷、黄芩苷2种成分提取效果最佳。仍以清肺排毒汤冻干物中橙皮苷、黄芩苷的综合提取率为指标，对超声处理和加热回流两种提取方式进行比对试验，以超声提取对2种成分的提取效果为佳。最后对15、30、45和60 min四个提取时间进行比对试验，结果超声45 min和60 min接近，为节省提取时间，最终选择超声45min。

3.4 流动相考察 实验中比较了甲醇-磷酸和乙腈-磷酸两种流动相系统，在乙腈-磷酸系统下橙皮苷和黄芩苷获得了更好的峰形和分离效果，最终确定以乙腈-0.2%磷酸溶液(20:80)为流动相。

3.5 耐用性考察 实验中考察了方法的耐用性：比较不同的色谱柱(Agilent ZORBAX SB C18、Capcell Pak C18、Thermo Scientific Syncronis C18)，结果供试品在3种色谱柱上均能得到较好的分离；考察柱温(20 ℃、25 ℃、30 ℃)对色谱分离的影响，结果表明柱温对本测定方法中两种成分的分离效果有较大的影响，柱温在30 ℃时两种成分与其前后峰的分离效果最佳，建议将柱温控制在30 ℃。

3.6 后续研究工作的探索 质量控制是开展中药及复方研究工作的首要问题[13-14]。本实验建立的同时测定清肺排毒汤冻干物中橙皮苷和黄芩苷2种黄酮类成分的含量测定方法，可为清肺排毒汤质量研究提供借鉴，为清肺排毒汤后续的成方制剂开发奠定研究基础。清肺排毒汤药味较多，化学成分复杂，除黄酮类成分外，还有生物碱等其他化学成分，对清肺排毒汤方中其它药味进行质量控制的研究可进一步深入。