不同乙肝病毒DNA载量的慢性乙型肝炎患者外周血中Th17/Treg表达及意义

陈丽龙 向尹 陈小娟 陈俊良 刘楷

慢性乙型肝炎(chronic active hepaititis B，CHB)可经血液、母婴等方式传播，近年来CHB发生率逐年升高[1]。乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)-DNA载量是评估CHB患者机体HBV活性的有效指标，HBV-DNA载量高说明HBV活性较强，传染性高，且可能会加重肝细胞损伤[2]。既往临床检测HBV-DNA载量多采用荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、竞争PCR等技术，此类方式虽可明确HBV-DNA载量情况，但检测时容易受其他因素干扰，且检测要求严格，不利于基层医院推广[3]。因此，需寻求可能与CHB患者HBV-DNA载量有关的血清学指标，辅助评估患者高HBV-DNA载量风险。研究指出，CHB的发生、发展与适应性免疫存在密切关系，机体免疫功能异常是导致HBV感染慢性化及肝损伤加重的重要原因之一[4]。辅助性T细胞-17(hlper T cell-17，Th-17)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是维持机体免疫重要细胞，其中Th-17可辅助调节炎性反应及免疫应答，而Treg可抑制T细胞效应及炎性反应[5]。胡萍等[6]研究证实Th-17、Treg与GHB发病存在密切联系，且可能会推进疾病发展。鉴于此，本研究通过探讨不同HBV-DNA载量的CHB患者外周血中Th17/Treg表达及临床意义，重点分析Th17/Treg表达与CHB患者HBV-DNA载量的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 前瞻纳入乐山市人民医院检验科检测的217例CHB患者为研究对象，男113例，女104例；年龄28～47岁，平均年龄(37.75±2.31)岁；体重指数(body mass index，BMI)17.2～24.7 kg/m2，平均(20.99±1.04)kg/m2；病程6～14个月，平均(10.33±1.22)个月。

1.2 入选标准 (1)纳入标准：①CHB符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]中相关标准；②在我院接受相关治疗，且可获得检测标本；③免疫系统正常；④精神正常，可配合研究。(2)排除标准：①合并甲型、丙型等其他类型肝炎；②合并肝癌或肝衰竭；③合并心肌炎、肾衰竭等其他脏器疾病；④接受抗病毒治疗；⑤哺乳或妊娠期患者。

1.3 方法

1.3.1 HBV-DNA载量检测及分组:采取患者入院时空腹状态下外周静脉血5 ml，离心 3 000 r/10 min，取血清进行乙肝DNA提取。180 μl乙肝DNA裂解液+80 μl血清+3 μl内标，充分震荡混匀瞬离后，金属浴加热，100℃ 10 min，随后用低温高速离心机进行离心。取上层清液20UL加入反应体系，进行PCR扩增反应(中山大学达安基因股份有限公司提供的乙肝DNA检测试剂盒)。先在93℃环境下预变性2 min，然后分别在93℃环境下反应45 s、55℃环境下反应60 s，共10个循环、93℃环境下反应30 s、55℃环境下反应45 s，共30个循环，最后采用全自动实时荧光定量PCR仪(宏石公司，型号：SLAN- 96P)测定HBV-DNA载量。根据HBV-DNA载量检测结果，将CHB患者分为低HBV-DNA载量组(<500 copies/ml)、中HBV-DNA载量组(500～1 000 copies/ml)、高HBV-DNA载量组(>1 000 copies/ml)。

1.3.2 外周血Th17、Treg检测:取患者入院时空腹状态下外周静脉血5 ml，用密度梯度离心法提出外周中单个核细胞；选取1×106个细胞标本，依次滴加佛波酯50 ng/ml、离子霉素1 μg/ml，并将标本置于1640培养基(含有高尔基蛋白转换抑制剂)中；待刺激5 h后，对标本进行离心、固定、染色处理，然后用流式细胞仪(BD公司，型号：BD FACS canto PLUS)测定外周血Th17、Treg表达，并计算Th17/Treg；检测试剂及试剂盒均购自BD公司。

1.3.3 主要肝纤维化指标检测:取患者入院时空腹状态下外周静脉血5 ml，以4 000 r/min转速离心10 min，使用血清用全自动生化分析仪(日立LABOSPECT，型号：008)测定谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

2 结果

2.1 CHB患者HBV-DNA载量情况及相关基线资料比较 217例CHB患者中低HBV-DNA载量64例，占29.49%(64/217)，中HBV-DNA载量118例，占54.38%(118/217)，高HBV-DNA载量35例，占16.13%(35/217)。3组间性别比、年龄、BMI等基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同HBV-DNA 载量CHB 患者相关基线资料比较

2.2 不同HBV-DNA载量CHB患者相关实验室指标比较 高HBV-DNA载量组ALT、AST、Th17、Treg、Th17/Treg水平均高于中HBV-DNA载量组、低HBV-DNA载量组，且中HBV-DNA载量组ALT、AST、Th17、Treg、Th17/Treg水平高于低HBV-DNA载量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同HBV-DNA 载量CHB 患者相关实验室指标比较

2.3 各主要变量与CHB患者HBV-DNA载量的关系分析 经Spearman相关性分析检验，CHB患者HBV-DNA载量与Th17/Treg、ALT、AST均呈正相关(r>0，P<0.05)，Th17/Treg分别与ALT、AST呈正相关(r>0，P<0.05)。见表3。

表3 各主要变量与CHB 患者HBV-DNA 载量的关系分析结果

3 讨论

HBV作为嗜肝DNA病毒，入侵机体后会结合肝细胞膜，损伤肝细胞，且可能会引发机体免疫应答，加重肝细胞损伤[8]。据报道，HBV感染引起的CHB，随着病情的进展容易出现肝纤维化，且可能会增加肝癌发生风险，威胁患者生命安全[9]。因此，寻求HBV-DNA载量相关血清指标，对辅助评估CHB患者HBV活性，指导早期干预尤为重要。

据报道，CHB患者HBV-DNA载量与肝纤维化程度存在一定关系，随着HBV-DNA载量的增加，肝纤维化程度加重[18]。ALT、AST是评估肝纤维化程度重要指标，二者高表达提示肝功能损伤严重[19]。本研究通过初步比较不同HBV-DNA载CHB患者ALT、AST表达，后经Spearman相关性分析检验结果显示，CHB患者HBV-DNA载量与ALT、AST均呈正相关。同时发现，Th17/Treg与ALT、AST也呈正相关，说明随着Th17/Treg的升高，ALT、AST水平上升，即肝纤维化风险增加或程度加重。分析原因在于，Th17/Treg失衡可能会减弱对HBV复制抵抗作用，从而导致HBV快速复制，加重肝细胞损伤，继而增加肝纤维化风险或加重已经发生肝纤维化患者的干纤维化程度[20]。但本研究并未探讨Th17/Treg预测CHB患者肝纤维化风险价值，研究结果存有局限，未来仍需展开大样本量、前瞻性研究加以验证。

综上所述，CHB患者HBV-DNA载量与外周血Th17/Treg呈正相关，且肝纤维化的发展也可能与Th17/Treg失衡有关，考虑未来可检测患者入院时Th17/Treg，辅助评估患者病情与肝纤维化情况，可能对遏制疾病进展有积极意义。