Moracin M的简便合成及其生物活性

2021-08-17李敏欣杜文绒高金春李艳平毛泽伟

合成化学 2021年7期

李敏欣, 杜文绒, 高金春, 李磊, 李艳平, 毛泽伟

(云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500)

苯并呋喃也称为香豆酮、氧茚，作为重要的生物活性基团广泛存在于天然产物和药物分子中，在抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化以及对心血管系统的保护作用等方面表现出优异的生理活性[1-6]，因此国内外学者对该类化合物进行了大量的研究[7-10]。从桑科植物中分离鉴定出了一系列Moracin族化合物，其生物活性及合成研究已受到越来越多的关注[11]，尤其以Moracin M作为代表。如Arias等[12]利用微波辅助手段完成了Moracin M的合成；Kinoshita等[13]利用Perkin 缩合等五步反应合成得到Moracin M； Maddali等[14]采用过渡金属钯催化偶联反应完成了Moracins (D, E, M)的合成。尽管对Moracin M的合成报道较多，但存在成本较高、反应条件苛刻或操作复杂等缺点。本文以4-甲氧基水杨醛和3,5-二甲氧基溴化苄为原料，经取代、缩合和水解等3步反应实现了Moracin M的合成(Scheme 1)，并对其抗氧化活性和抗炎活性进行了初步研究。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Schimadzu UV-2450型紫外分光光度计；Bruker AM 400型核磁共振波谱仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；AutoSpec Premier P776 型双聚焦三扇型磁质谱仪。

所用试剂均为化学纯或分析纯。

1.2 合成

(1) 化合物3的合成

称取4-甲氧基水杨醛1.52 g(10 mmol)、 3,5-二甲氧基溴苄2.77 g(12 mmol)、碳酸钾2.76 g(20 mmol)于100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL无水N,N-二甲基甲酰胺，100 ℃反应6 h，冷却至室温后加入50 mL乙酸乙酯搅拌。有机层用水(3×20 mL) 洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。将残余物溶于20 mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入叔丁醇钾2.24 g(20 mmol)，置于160 ℃油浴反应6 h(TLC检测)。冷却至室温，加入50 mL乙酸乙酯，有机相用水(3×20 mL) 洗涤，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物经硅胶柱(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=20/1,V/V) 层析纯化得淡黄色固体(3) 1.19 g，两步收率42%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:7.52(d,J=8.6 Hz, 1H), 7.37(d,J=5.6 Hz, 1H), 7.25(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.02(d,J=2.3 Hz, 2H), 6.88～6.91(dd,J=8.6 Hz, 8.6 Hz, 1H), 6.52(s, 1H), 3.83(s, 6H), 3.82(s, 3H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ:161.4, 158.5, 155.8, 154.6, 132.3, 121.7, 112.7, 103.0, 102.6, 100.9, 96.4, 56.0, 55.8。

(2) Moracin M的合成

称取化合物3564.6 mg(2 mmol)于25 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水二氯甲烷，在冰水浴搅拌下滴加三溴化硼4 mL(2.0 mol/L in DCM， 8 mmol)，并升至室温反应12 h(TLC检测)。缓慢滴加20 mL冰水，搅拌0.5 h后用正丁醇萃取(3×10 mL)，有机相用水(2×20 mL) 洗涤，无水硫酸钠干燥、减压浓缩，残余物经硅胶柱(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇=10/1,V/V) 层析纯化得白色固体435 mg，收率90%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.59(s, 1H), 9.44(s, 2H), 7.41(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.09(s, 1H), 6.95(s, 1H), 6.77(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.71(s, 2H), 6.23(s, 1H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ:159.3, 156.2, 155.7, 154.4, 132.2, 121.6, 121.3, 112.9, 103.1, 102.8, 102.0, 98.0; HR-MSm/z: Calcd for C14H9O4{ [M-H]-} 241.0501, found 241.0504。

1.3 抗氧化活性

采用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除法测定目标化合物的抗氧化能力。以甲醇为参比，在517 nm处测定2.0 mL DPPH反应液+0.5 mL甲醇混合溶液的吸光度A0；取0.5 mL稀释为不同浓度梯度的样品溶液于5 mL离心管中，加入2.0 mL的0.1 mmol/L的DPPH反应液混合均匀将混合反应液暗处放置并不断震荡30 min，于517 nm处测定其吸光度AX；配置设定好浓度的样品溶液后各取200 μL于96孔板中在酶标仪下测定其吸光度AX0。

1.4 抗炎活性

(1) 细胞毒性检测

将冻存好的RAW 264.7细胞从液氮罐中拿出，迅速解冻，吸入含10 mL DMEM培养基(含10% FBS，1%双抗)的培养皿中。将培养皿置于37 ℃、 5% CO2培养箱中培养。每天对细胞进行换液或传代，实验用细胞代数为2～15代。将细胞从培养箱中取出，每个培养皿中加入5 mL左右PBS，用移液枪轻轻吹打细胞，直至培养皿上的细胞被全部吹打下来。细胞计数后按照所需细胞密度(1×105)进行稀释，之后按照每孔100 μL加入细胞悬液。振荡均匀，置37 ℃、 5% CO2培养箱中培养24 h。将96孔板中的细胞悬液吸走，每孔加入100 μL已配制好的不同浓度的样品溶液。继续放入培养箱中培养24 h。取出96孔板，避光加入MTT(每孔10 μL)，继续放入培养箱培养4 h，后弃上清，每孔加入150 μL DMSO溶液。振荡均匀，490 nm处测定OD值，计算细胞存活率。

(2) NO含量检测

以脂多糖诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞为炎症模型，以MTT检测细胞活力，用Griess试剂显色法测定细胞模型中NO的产生。取RAW 264.7细胞吹打均匀，按细胞密度为3×105个/孔将细胞悬液加入24孔板中，接种后置于37 ℃培养箱中培养24 h。炎症模型组用1 μg/mL的LPS进行诱导，记为LPS组，实验组则加入测试样品，未处理的细胞记为空白对照组。取出已培养了24 h的RAW 264.7细胞，弃上清，每孔加入500 μL样品溶液(每个样品设置3组)，置于37 ℃培养箱中孵育24 h后，取出24孔板，吸取上清按照NO试剂盒说明书用酶标仪测定在540 nm处的OD值，计算NO含量[15]。

2 结果与讨论

2.1 合成

以4-甲氧基水杨醛和3, 5-二甲氧基溴苄为原料，参照文献[16]的方法制备得到化合物2后，在叔丁醇钾存在下经缩合、三溴化硼水解，以较高收率完成了Moracin M的合成。在合成化合物3时，收率较低，为此对反应条件进行了优化，考察了不同碱对反应效果的影响，见表1所示。结果表明，以叔丁醇钾为碱，DMF为溶剂时反应效果最好。

表1 碱对3的影响

2.2 抗氧化活性

以50%清除率时的样品质量浓度(mg/mL)，即IC50值来衡量化合物清除DPPH自由基的能力，IC50值越小，则表示样品的抗氧化活性越强。Moracin M对清除DPPH自由基的IC50值为0.0267 μmol/L，而阳性对照药VC为0.0433 μmol/L。与阳性对照药物VC比较，Moracin M对DPPH自由基的清除能力约为阳性对照药VC的1.6倍，具有很好的抗氧化活性。

2.3 抗炎活性

细胞毒性检测结果：当化合物浓度在1.5625、 3.125、 6.25、 12.5和25 μmol/L时，细胞存活率分别为88.09%、 87.94%、 66.28%、 22.51%和2.75%。由此可知，该化合物存在较低细胞毒性。

采用脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞炎症模型(LPS-RAW264.7)测试Moracin M的体外抗炎活性，结果见图 1。从中可以看出，LPS模型组与空白对照组相比，NO含量增高，而给药组能够降低NO含量，并呈剂量依赖关系。因此，Moracin M对NO的产生具有一定的抑制作用，其可作为一种潜在的抗炎药物进行深入研究。