基于网络药理学的甲泼尼龙治疗腹膜纤维化作用机制研究*

蔡家驹，戴卫波，吴惠妃，叶秋明，萧俊祺

（广东省中山市中医院，广东 中山 528400）

腹膜纤维化（PF）为长期腹膜透析（PD）患者的主要和严重并发症，是导致PD 失败的主要原因［1］，目前仍缺乏有效的防治措施。甲泼尼龙（MP）属糖皮质激素，具有抑制结缔组织中成纤维细胞增生及胶原合成的作用，可用于治疗以增生为主的慢性炎症，如肺间质纤维化［2］。网络药理学可借助分子生物学和相关数据库信息，从组织水平预测药物对疾病治疗作用的机制［3］。本研究中采用网络药理学的方法，通过构建并分析化学成分－疾病－作用靶点网络，从整体上揭示MP 治疗PF 多靶点、多途径的作用机制，为进一步探讨MP 治疗PF 的疗效提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 运用数据库和工具

数 据 库 ：PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／），Swiss Target Prediction （http：／ ／www. swisstargetprediction.ch ／），GeneCards（https：／ ／www.GeneCards.org ／）， OMIM（https：／ ／omim.org ／）， STRING v11.0（http：／ ／String － db.org ／）。工具：Bioconductor（http：／ ／www.Bioconductor.org ／），R v3.6.3 软 件 （https：／ ／www.r－ project.org ／），Cytoscape v3.7.2 软件（http：／ ／Cytoscape.org ／）。

1.2 化学成分作用靶点预测

通过PubChem 数据库检索MP 的化学结构，并以sdf 格式保存其 2D 结构，然后将 sdf 文件导入Swiss Target Prediction 数据库中，限定研究物种为人类（Homospiens），查询MP 的潜在作用靶点信息。

1.3 疾病靶点预测

以“Peritoneal Fibrosis”作为关键词，在 GeneCards数据库和OMIM 数据库中分别检索，查找与PF 相关的基因，合并相关数据库，删除重复和假阳性基因，获得PF 的作用靶点信息数据集。

1.4 化学成分－疾病－作用靶点预测

采用编程软件R v3.6.3 编写命令代码，分别导入1.2 与1.3 项下所得相关靶点信息文件，并绘制 Venn图，获得MP 靶点基因和PF 靶点基因交集文件，用于网络构建与分析。

1.5 化学成分－疾病－作用靶点网络构建和分析

根据 1.4 项下的作用靶点预测结果，使用Cytoscape 3.7.2 软件构建化学成分－疾病－作用靶点网络，节点代表药物、疾病及作用靶点；边分别用作连接药物与作用靶点、疾病与作用靶点，体现化学成分－疾病－作用靶点间的联系。

1.6 蛋白质－蛋白质相互作用（PPI）网络构建和分析

利用 STRING v11.0 数据库导入 MP 和 PF 的共同靶点基因文件，限定研究物种为人类（Homosapiens），搜索获得PPI 网络，并以tsv 格式文件导出。将该文件中node1，node2，Combined score 信息分别导入 Cytoscape v3.7.2 软件，构建 PPI 网络，然后利用该软件的插件Network Analyzer 分析网络拓扑参数，获取节点度（degree）、介数中心性（BC）、紧密中心性（CC）等网络信息。

1.7 靶点生物功能注释分析

Bioconductor 是一个通过应用编程软件R 对高通量基因组数据进行分析和解释的工具。首先加载Bioconducter 的Clusterprofiler 包，然后导入作用靶点的基因数据并运行代码，对化学成分－疾病－作用靶点网络中的基因进行基因本体（GO）功能注释，以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设定P ＜0.01 为有显著性，将结果分别以柱状图和气泡图形式呈现，并根据富集因子值分析核心通路的富集程度，展示MP 治疗PF 的作用通路。

2 结果

2.1 化学成分靶点预测结果

利用Swiss Target Prediction 数据库合并重复数据后，共收集到MP 的潜在靶点100 个。其中，核受体占26.7%，分泌蛋白占 20.0%，酶占 13.3%。详见图 1。MP占比居前10 位的作用靶点基因见表1。

图1 MP 潜在靶点分类Fig.1 Classification of potential targets of MP

表1 MP 占比前10 位作用靶点基因Tab.1 Top 10 MP target genes

2.2 PF 靶点预测结果

检索GeneCards 和OMIM 数据库，合并数据并剔除重复靶点后，共获得2 104 个PF 疾病靶点基因。靶点类型主要为蛋白质（Protein Coding）和 RNA 基因（RNA Gene）。按相关性得分大小列出前10 位靶点基因，详见表2。

表2 PF 相关性居前10 位的作用靶点基因Tab.2 Top 10 PF target genes

2.3 化学成分－疾病－作用靶点预测结果

将MP 及PF 各自的作用靶点信息导入编程软件R，通过绘制Venn 图，共获得65 个共同靶点基因（见图2）。分别为白细胞介素6（IL－6）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、丝裂原活化蛋白激酶 3（MAPK3）、丝裂原活化蛋白激酶 14（MAPK14）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），以及TJP1，ALOX12，SOD2，CCNE1，MUC1，RAB7A，HBB，DICER1，NR3C1，AR，ADAM17，GLUL，GPBAR1，SHBG，PGR，CYP19A1，HSD11B2，NOS2，ADORA3，ESR2，PTGS1，CDC25A，PRKCA，MPO，TKT，CA12，CDK1，CREBBP，XIAP，RBP4，MAP3K5，JAK1，MAP2K1，SLC5A1，HLCS，ALPL，GRK2，CNR1，EIF2AK3，JAK2，PTPN11，ERBB2，ERBB4，PARP1，ADK，MAP3K8，SLC18A3，ALOX5，CDK2，KIT，FLT3，PIM1，KDR，MAP2K2，PIK3CA，ALK，ADORA1，OPRM1，TTR。

图2 65 个共同靶点基因的Venn 图Fig.2 Venn diagram of 65 common target genes

2.4 化学成分－疾病－作用靶点网络分析

使用 Cytoscape v3.7.2 软件导入 MP 与 PF 的共同靶点基因，建立化学成分－疾病－作用靶点网络关系图（见图 3）。

图3 化学成分－疾病－作用靶点网络关系图Fig.3 PPI network diagram of ingredient－disease－target

2.5 PPI 网络分析

将 MP 与 PF 的共同靶点基因导入 STRING v11.0数据库中，获取一个包含65 个节点和383 条边的PPI网络（见图 4）。采用 Cytoscape v3.7.2 软件分析其拓扑性质，一般认为节点度（degree）值不低于所有节点度2 倍中位数的节点，即对整个网络具有重要贡献意义。65 个共同靶点中，degree 值大于中位数（degree ＝ 12）2 倍的靶点共有 8 个（见表 3）。

表3 PPI 网络分析结果（degree ＞ 24）Tab.3 Results of PPI network analysis（degree ＞ 24）

图4 65 个共同靶点PPI 网络分析图Fig.4 PPI network diagram of 65 common target

2.6 GO 功能注释及KEGG 通路富集分析结果

为进一步阐明MP 对PF 的作用机制，利用Bioconductor 输入代码，对化学成分－疾病－作用靶点网络中的65 个靶点进行GO 功能注释，结果共获得53 个条目，其中具有显著意义（P ＜ 0.01）的有 19 条。由图 5 和图 6 可见，MP 靶点主要富集在 protein serine／threonine kinase activity（GO：0004674），protein tyrosine kinase activity（GO：0004713），phosphatase binding（GO：0019902），transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity（GO：0004714），transmembrane receptor protein kinase activity（GO：0019199），steroid binding（GO：0005496），heme binding（GO：0020037），protein phosphatase binding（GO：0019903），tetrapyrrole binding（GO：0046906），hormone receptor binding（GO：0051427）等生物过程中。此外，通过KEGG 分析富集到MP 与PF 治疗靶点相关的基因通路共 10 条（图 7 和图 8），具有显著意义（P ＜0.01）的有7 条，包括 MAPK signaling pathway（hsa04010），EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance（hsa01521），Rap1 signaling pathway（hsa04015）， Ras signaling pathway（hsa04014），ErbB signaling pathway（hsa04012），Endocrine resistance（hsa01522），Platinum drug resistance（hsa01524）等。

图5 65 个共同靶点的GO 分析结果柱状图Fig.5 A bar chart of GO enrichment analysis of 65 common targets

图6 65 个共同靶点的GO 分析结果气泡图Fig.6 A bubble chart of GO enrichment analysis of 65 common targets

图7 65 个共同靶点的KEGG 通路富集分析结果柱状图Fig.7 A bar chart of KEGG enrichment analysis of 65 common targets

图8 65 个共同靶点的KEGG 通路富集分析结果气泡图Fig.8 A bubble chart of KEGG enrichment analysis of 65 common targets

3 讨论

本研究中通过网络药理学的方法，利用多个在线数据库，收集到100 个不重复的MP 作用靶点，并预测到2 104 个不重复的PF 疾病靶点，通过绘制Venn 图得到65 个共同靶点基因，并以此构建了化学成分－疾病－作用靶点网络，获得了1 个具有65 个节点和383 条边的PPI 关系网络；网络分析结果显示，在65 个作用靶点中，degree 值大于 24 的靶点有 8 个，包括 IL－6，MAPK3，MAPK1，EGFR，mTOR，MAPK14 等；此外，通过GO 功能注释和KEGG 富集分析，对65 个共同靶点基因进行了分析，并根据 P ＜0.01 确定了 19 条 GO 分析信息及7 条作用通路，如蛋白丝氨酸／苏氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、MAPK 信号通路和EGFR 信号通路等。

IL－6 是一种多效性细胞因子，能刺激细胞生长，促进细胞外基质增生，参与炎性反应。IL－6 可由成纤维细胞、间皮细胞和血管内皮细胞等多种细胞生成。在PD 过程中，腹腔会局部产生IL－6，且在产生腹膜炎时明显升高［4－5］。经常性炎性反应可激活适应性免疫反应，使基质中的细胞因子信号转导发生改变，从而导致纤维化和慢性炎症［6］。上皮间质分化（EMT）是指上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程，在慢性炎症和多种纤维化疾病中发挥重要作用［7］。研究证实，IL－6通过激活JAK2／STAT3 信号通路，诱导人腹膜间皮细胞（HPMC）发生 EMT，最终引起 PF［8］。糖皮质激素具有明显的抗炎作用，可抑制肿瘤坏死因子－α（TNF－α），IL －6，IL －8 等多种炎性细胞因子生成。因此，MP 可能通过调控IL－6 起到抑制PF 的作用。

mTOR 是位于磷脂酰肌醇3 激酶 ／丝氨酸激酶（PI3K／AKT）通路下游的一种重要的丝氨酸／苏氨酸激酶，在细胞内作为功能性亚基参与mTORC1 和mTORC2 2 种复合体的形成。mTORC1 可被生长因子、氨基酸、氧、能量等激活，通过影响mRNA 翻译，蛋白质、脂质和核苷酸的合成，细胞自噬等生物过程调控细胞的生长代谢［9］。mTORC2 的功能主要体现在细胞存活、迁移等方面［10］。研究显示，PI3K －AKT － mTOR 信号通路的异常与多种纤维化性疾病有关，如肺纤维化［11］、肾脏纤维化［12］等。转化生长因子 β1（TGF － β1）是公认的强致纤维化因子。近年来有学者发现，HPMC 在 TGF － β1的刺激下，mTOR 信号通路活化及纤维化改变，提示mTOR 信号通路也参与到 PF 的发生、发展过程中［13］。据此推测，调控mTOR 通路可能是MP 治疗PF 的一个重要途径。

根据KEGG 通路富集分析结果，MAPK 通路富集基因最多，如PPI 网络分析中dgree 值较高的靶点MAPK3（ERK1），MAPK1（ERK2），MAPK14（p38α）均属 MAPK家族成员。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路主要有细胞外调节蛋白激酶（ERK1／2）、Jun 氨基末端激酶（JNK）和 p38 3 条通路。ERK1 ／2 通路可调控细胞的生长和分化，JNK 和p38 通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。研究显示，ERK1／2 和p38 信号通路均参与了 PF 的发病过程［14－17］，两者在 TGF － β1致HPMC 细胞外基质过度表达中起调控作用［15－17］。因此，MP 可能通过作用于 MAPK 通路中的 ERK1／2 和 p38信号通路，实现对PF 的调控。

EGFR 是一种具有酪氨酸激酶活性的受体，受表皮生长因子（EGF）和TNF－α 等配体的激活后，通过信号转导将有丝分裂的信号从细胞表面传到细胞核内，从而调节细胞的生长、增殖、分化等生理过程。研究发现，PD患者的 HPMC 表达 EGFR 及其配体 EGF［18］，EGFR 信号通路的激活参与了 HPMCs 的 EMT 过程［19］，给予 EGFR 阻断剂后可减少 PF 程度［19－20］。由此推测，MP 可能也通过干扰EGFR 信号通路的激活机制而起到抑制PF 的作用。

综上所述，采用网络药理学的方法，通过构建化学成分－疾病－作用靶点相互作用网络，发现MP 可能具有抗 PF 的作用，其作用机制与 IL －6，mTOR，EGFR，MAPK 通路等相关。