黄芪注射液对病毒性心肌炎患者外周血NLRP3 炎性小体表达的影响∗

谢红英，罗晓丽，卢 慧

1 陆军军医大学（第三军医大学）大坪医院野战外科研究所心血管内科，重庆400042；2 中交二航局第二工程有限公司卫生所

病毒性心肌炎是由嗜心肌性病毒引起的心肌局限性或弥漫性炎性病变，导致炎性细胞向该部位聚集，过度的炎症反应可进一步损伤心肌细胞，影响心功能。病毒性心肌炎患者机体炎症水平升高，主要表现为肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋 白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors family pyrin domain containing 3,NLRP3）是炎症反应的重要组成部分，可激活及放大下游炎症反应，参与众多炎症性疾病如器官缺血再灌注损伤、慢性病毒性肝炎、急性病毒性心肌炎等的发生、发展过程［1-3］。目前病毒性心肌炎尚无特效治疗方法，但相关研究［4］显示中成药物的辅助治疗具有一定疗效，特别是以黄芪注射液为代表的中成药物可提高临床疗效，但具体机制尚不明确。因此，本研究通过探讨黄芪注射液对病毒性心肌炎患者外周血NLRP3 炎性小体及相关通路的影响，为阐明该药物的作用机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料将2015年8月至2018年8月于陆军军医大学在坪医院就诊的病毒性心肌炎患者160 例，根据随机数字表法分为观察组和对照组各80例。观察组中男43例，女37例；年龄22～65岁，中位年龄43.3 岁；病程（6.10±1.20）天。对照组中男42 例，女38 例；年龄24～66 岁，中位年龄44.2 岁；病程（5.96±1.12）天。两组患者基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。该研究获医院伦理委员会批准并征得患者书面知情同意。

1.2 诊断标准符合病毒性心肌炎诊断与治疗指南［5］。

1.3 排除标准1）有冠心病、感染性心内膜炎及心脏瓣膜病者；2）存在自身免疫性疾病和免疫缺陷者；3）恶性肿瘤患者。

1.4 设备及试剂荧光定量PCR仪（美国Biorad公司）；人淋巴细胞分离液（美国Sigma公司，批号：Histopaque-1077）；逆转录试剂盒（Takara公司，批号：RR037A）、实时荧光定量试剂盒（Takara公司，批号：DRR820A）；人血清IL-1β试剂盒（中国博士德公司，批号：EK0392）和IL-18酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（中国博士德公司，批号：EK0864）。

1.5 治疗方法对照组予常规治疗：抗病毒、维生素C 片、极化液、辅酶Q10 胶囊等。观察组在常规治疗基础上加用黄芪注射液（哈尔滨圣泰生物制药，国药准字Z23020820，规格：2 mL/支）20 mL，加入250 mL 的5%葡萄糖注射液（科伦药业股份公司，国药准字H51020636，规格：250 mL/袋）静脉滴注，每日1次，连续2周。

1.6 观察指标

1.6.1 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）分离方法 分别取两组患者入院后12 h 和治疗2 周后静脉血3 mL，置于EDTA 抗凝管，按照1∶1 比例与人外周血淋巴细胞分离液混匀后离心，分离PBMCs，将1 mL Trizol加入PBMCs中混匀后备用。

1.6.2 炎性小体NLRP3 及Caspase-1 mRNA 水平qRT-PCR 检测 运用Trizol 法提取两组PBMCs 总RNA，测定RNA 浓度，然后按逆转录试剂盒说明书进行逆转录。其中qPCR 引物由上海生工公司设计合成，NLRP3 上游引物：5’-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3’，下游引物：5’-GCTTCAGTCCCACACAGA-3’；Caspase-1上游引物：5’-ATCGCTTTCTGCTCTTCCAC-3’，下游引物：5’-TCCTCCACATCACAGGAACA-3’；内参GAPDH上游引物：5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，下游引物：5’-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3’。依据TaKaRa公司提供的荧光定量PCR试剂盒说明书建立20µL反应体系，反应条件：预变性，95℃120 s，95℃5 s，60℃30 s，40 个循环；溶解曲线：95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。以GAPDH为内参，计算各组相应基因的ΔΔCT 值，以目的基因的量为定量结果进行统计分析。

1.6.3 外周血细胞因子（IL-1β、IL-18）及心肌损伤标志物（cTnI、CKMB）检测 取两组患者入院后12 h 和治疗2 周后清晨空腹静脉血4 mL，离心后收集上清，采用ELISA 法测定外周血IL-1β、IL-18水平。采用LX-20全自动生化分析仪测定心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）和肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzymes-MB,CKMB）水平。

1.6.4 疗效判定及不良反应 根据病毒性心肌炎治疗效果标准分为临床治愈、显效、有效及无效［5］。记录患者治疗期间不良反应发生情况，包括恶心呕吐、头痛、腹部不适等。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0 分析数据，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效观察组临床治愈、显效、有效、无效及总有效分别为40 例（50.0%）、16 例（20.0%）、17例（21.3%）、7例（8.7%）及73例（91.3%），对照组分别为32例（40.0%）、12例（15.0%）、20例（25.0%）、16 例（20.0%）及64 例（80.0%），总有效率观察组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA及IL-1β和IL-18水平治疗后两组患者外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA 及IL-1β和IL-18 水平均较治疗前降低，观察组降低更明显（P＜0.05），见表1。

表1 两组患者治疗前后外周血NLRP3、Caspase-1 mRNA及IL-1β和IL-18水平比较（±s）

表1 两组患者治疗前后外周血NLRP3、Caspase-1 mRNA及IL-1β和IL-18水平比较（±s）

注：*表示与治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别对照组观察组例数80 80时间治疗前治疗后治疗前治疗后NLRP3 mRNA 0.99±0.07 0.78±0.10*0.98±0.06 0.59±0.11*#Caspase-1 mRNA 1.02±0.10 0.75±0.12*1.03±0.09 0.60±0.08*#IL-1β（pg/mL）38.10±6.20 28.20±5.16*39.60±4.50 23.26±4.80*#IL-18（pg/mL）39.50±5.10 27.90±5.40*40.80±6.05 22.51±4.60*#

2.3 心肌损伤标志物水平治疗后两组患者血清CKMB、cTnI 水平均较治疗前降低，观察组降低更明显（P＜0.05），见表2。

表2 两组患者治疗前后心肌损伤标志物水平比较（±s）

表2 两组患者治疗前后心肌损伤标志物水平比较（±s）

注：*表示与治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别对照组观察组例数80 80时间治疗前治疗后治疗前治疗后CKMB（U/L）26.60±3.58 19.40±4.10*27.50±4.51 14.20±3.62*#cTnI（µg/L）0.72±0.08 0.45±0.05*0.75±0.07 0.36±0.06*#

2.4 不良反应发生情况治疗期间对照组出现恶心呕吐1 例、头痛1 例、腹部不适1 例，观察组出现恶心呕吐2 例、头痛1 例、腹部不适1 例，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

病毒性心肌炎发病机制复杂，其可能与病毒或其毒素直接损伤心肌细胞，导致细胞凋亡或坏死，同时心肌细胞释放大量自身抗原。机体通过固有免疫，激活Toll样受体2，进而促进外周血单核细胞分泌IL-12、IL-1β、TNF-α，聚集于受损的心肌局部，在局部形成炎症反应，发挥免疫应答作用［6］。由免疫炎性体介导的炎症反应已参与了多种炎症性疾病的发生、发展过程。NLRP3 是由胞浆内多种蛋白质组成的复合体，其含有凋亡相关微粒蛋白、Caspase-1 等，是天然免疫系统的重要组成部分［7］。机体NLRP3活性通常处于抑制状态，当NLRP3 受外在刺激被激活时，活化的Caspase-1随后激活IL-1β和IL-18，产生炎症级联反应。相关研究［8］显示，NLRP3炎性小体参与了病毒性心肌炎的发生、发展过程，抑制NLRP3 炎性小体激活，可抑制下游炎性通路的级联放大，改善病毒性心肌炎大鼠心功能。

目前，病毒性心肌炎的治疗尚无特效方法，临床常对症支持治疗。相关研究［9］显示，中医辅助治疗该病有较好的临床效果。中医认为病毒性心肌炎发病源于气阴两虚，治疗强调益气养阴活血化瘀。有研究显示黄芪注射液可提高病毒性心肌炎患者临床疗效［10］，但相关机制尚未阐明。黄芪注射液富含黄芪皂苷，具有益气固表、养心通脉等作用，可清除自由基，降低炎症反应，改善心肌缺血缺氧状态［11-12］。作为炎症反应的重要组成部分，NLRP3 炎性小体可启动炎性通路的激活及级联放大。NLRP3 炎性小体的激活参与了众多炎症性疾病发生、发展过程，通过抑制NLRP3 炎性小体的激活，可提高疾病治疗效果及预后［13］。本研究结果显示，黄芪注射液可降低外周血NLRP3 炎性小体水平，抑制下游炎性通路的级联放大，抑制炎症反应，进一步减轻心肌损伤，降低患者心肌损伤标志物CKMB 和cTnI 水平，提高临床疗效，同时不增加不良反应发生率。

综上所述，NLRP3 炎性小体参与了病毒性心肌炎的炎症反应，黄芪注射液可抑制NLRP3 炎性小体激活，降低炎症反应，提高临床疗效。但本研究存在一定局限性，如入选病例相对较少，下一步需加大样本量，采取多中心联合的方式探讨黄芪注射液对病毒性心肌炎外周血NLRP3 炎性小体表达的影响。