聚焦网络药理学：黄芩苷治疗急性牙周炎的效应机制研究∗

顾 磊，廖 维，周建萍

1 重庆市消防救援总队医院口腔科，重庆401122；2 陆军医科大学附属第二医院新桥医院麻醉科；3 重庆医科大学附属口腔医院正畸科

急性牙周炎是以牙周支持组织炎症为主的一种常见疾病，主要表现为患者牙组织周围出现不同程度的疼痛及肿胀，临床多采用中西医结合的治疗方法［1］。急性牙周炎属中医学“牙痛”范畴，多由热盛所致而以清热立法［2］，黄芩为最重要的清热药之一，是急性牙周炎临床处方中的常用药，如杨靖靖等［3］自拟三黄健齿汤，张文娟等［4］自拟牙周败毒饮等均重用黄芩，并且取得了显著疗效，此外如黄连解毒汤、普济消毒饮等治疗急性牙周炎的常用古方也多用黄芩以清热，黄芩苷既是黄芩的主要成分之一，也是使用黄芩的一些处方中发挥疗效的主要活性物质之一，如徐田等［5］认为黄芩苷是黄连解毒汤中最重要的化合物成分。然而，中药及其化合物具有多靶点、多通路药效特点，现阶段与黄芩苷效应机制相关的动物研究、细胞研究等仍缺乏系统研究，导致与黄芩苷药效多靶点作用机制的认识存在一定的差距［6-9］，因此采用网络药理学方法从整体、系统的角度阐述药物、靶点和疾病之间的关系［10-11］，直观呈现药物靶点网络［12］，有助于理解药物的多药理学及其对生物网络的影响，以提高临床疗效［13］。本研究利用药物靶点预测、蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络构建、拓扑筛选等网络药理学方法，揭示黄芩苷治疗急性牙周炎的作用机制，明确其药用价值，为黄芩苷治疗急性牙周炎药效机制的定位和产生协同作用的潜在蛋白靶点的确定提供研究方法。

1 材料与方法

1.1 黄芩苷化合物信息收集黄芩苷化合物信息来自NCBI pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ZINC数据库（http：//zinc.docking.org/）［14-15］。黄芩苷吸收、分布、代谢和排泄（ADME）筛选标准包括生物利用度（ob）、药物相似性（dl）、血脑屏障（bbb）等，数据来自中药系统药理学（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/）数据库［16］。

1.2 黄芩苷化合物靶点预测采用两种方法预测黄芩苷的靶点信息。在NCBI 数据库（PubMed Central，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）通过检索“黄芩苷”文献，获得已知的黄芩苷靶点；在Pharmmapper数据库（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）通过反向药效团映射方法识别小分子潜在靶点［17］。

1.3 急性牙周炎疾病相关靶点收集及PPI 网络建立通过DiseaseGene Network（http：//www.disgenet.org/）收集各种疾病的相关基因，在“DiseaseGene Network”设置窗口中将“Select Source”设置为“All”，将“Select Association Type”设置为“Any”，将“Select Disease Class”设置为“Acute periodontitis”，查询急性牙周炎疾病相关靶点信息［18］。基于DiseaseGene Network 数据库查找急性牙周炎疾病相关靶点，并在STRING 数据库（https：//string-db.org/）建立PPI网络［19］。

1.4 基因映射收集黄芩苷治疗急性牙周炎的相关靶点应用Cytoscape 软件将黄芩苷的靶点映射在急性牙周炎疾病相关靶点的PPI 背景网络上，提取黄芩苷治疗急性牙周炎的预测靶点。

1.5 拓扑分析提取黄芩苷治疗急性牙周炎的核心靶点在Cytoscape 软件对获取的黄芩苷治疗急性牙周炎的相关靶点计算3个拓扑性质“Degree”“ClosenessCentrality”和“Betweenness Centrality，选取3 个指标均大于中位数的靶点［20］，筛选出具有拓扑重要性的“Hub”节点，定义为黄芩苷治疗急性牙周炎的核心靶点。

1.6 黄芩苷治疗急性牙周炎预测靶点的PPI 网络建立及富集分析基于收集获得的黄芩苷治疗急性牙周炎的预测靶点，在STRING 数据建立PPI网络［18］，选择具有高置信度的PPI 进行进一步研究（low confidence：score＜0.4；medium：0.4-0.7；high：＞0.7）。

在DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）［21］数据库进行富集分析，包括生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular constituent，CC）、分子功能（molecular function，MF）及作用通路。选取P＜0.05的分析结果，定义为黄芩苷治疗急性牙周炎的相关作用通路及BP、CC、MF；选取P＜0.01，FDR＜1 的分析结果，定义为黄芩苷治疗急性牙周炎的核心作用通路及BP、CC、MF。

基于收集获得的黄芩苷治疗急性牙周炎的预测靶点，在KEGG 数据库［22］搜索并建立核心通路的路线图，标注通路内的预测作用靶点。

1.7 黄芩苷治疗急性牙周炎“靶点-通路”网络建立基于收集获得的黄芩苷治疗急性牙周炎的预测靶点及DAVID 数据库进行通路富集分析的黄芩苷治疗急性牙周炎的核心通路，在Cytoscape软件建立黄芩苷治疗急性牙周炎的“靶点-通路”网络。

2 结果

2.1 黄芩苷化合物信息及预测靶点在TCMSP中获得了黄芩苷化合物信息（PubChem CID：64982），包括MW=446.39，OB（%）=40.12，DL=0.75，BBB=-1.74，黄芩苷2D结构式，Canonical SMILES结构式为C1=CC=C（C=C1）C2=CC（=O）C3=C（C（=C（C=C3O2）OC4C（C（C（C（O4）C（=O）O）O）O）O）O）O。研究采用两种方法预测并获得了黄芩苷332 个潜在人类蛋白质靶点，这些靶点来自7302个药效团模型。见图1。

图1 黄芩苷化合物2D结构

2.2 急性牙周炎疾病相关靶点及PPI 网络的建立在DiseaseGene Network 数据库共收集获得了急性牙周炎的44 个预测靶点。在STRING 数据库建立急性牙周炎的PPI 网络，获得了一个44 个节点、343条边的PPI网络，见图2。

图2 急性牙周炎44个靶点的PPI网络

2.3 基因映射结果与拓扑分析结果

2.3.1 基因映射 在Cytoscape 软件中，将黄芩苷353 个预测靶点映射在以急性牙周炎PPI 网络为背景的网络上，获得了黄芩苷治疗急性牙周炎的13个预测靶点，见图3。

图3 基因映射提取黄芩苷治疗急性牙周炎的预测靶点

2.3.2 拓扑分析 黄芩苷治疗急性牙周炎的13个预测靶点“Degree”中位数为10，“Closeness Centrality”中位数为0.85714286，“Betweenness Centrality”中位数为0.01515152，其中“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Centrality 均大于中位数的具有重要拓扑意义的节点共6 个，即“Hub”节点，为黄芩苷治疗急性牙周炎的核心靶点，见表1。

表1 黄芩苷治疗急性牙周炎的“Hub”节点

2.4 黄芩苷治疗急性牙周炎预测靶点的PPI 网络建立、富集分析及“靶点-通路”网络建立基于收集获得的13 个黄芩苷治疗急性牙周炎的预测靶点，建立PPI 网络，获得了一个13 个节点、58 条边的PPI 网络，选择高置信度PPI 获得了一个13 个节点、38条边的PPI网络，见图4。

图4 黄芩苷治疗急性牙周炎的预测靶点高置信度PPI网络

对收集获得的黄芩苷治疗急性牙周炎的13个靶点进行富集分析，P＜0.05 的富集分析结果包括34 个BP，4 个CC，5 个MF，5 个相关作用通路。其中P＜0.01，FDR＜1 的富集分析结果包括21 个BP，3个CC，2个MF及4个核心作用通路。见图5。

图5 黄芩苷治疗急性牙周炎“靶点-通路”网络图

基于富集分析结果，建立了黄芩苷治疗急性牙周炎的“靶点-通路”网络图。基于KEGG 建立的4个核心作用通路的可视化通路网络图建立黄芩苷治疗急性牙周炎的可视化通路网络图。见图6。

图6 黄芩苷治疗急性牙周炎的可视化通路网络图

3 讨论

急性牙周炎是一种破坏性的牙周炎性疾病，其炎症反应包括水肿形成、白细胞浸润和炎症介质释放，发病机制网络复杂，但以炎症反应为核心，炎症可从牙龈组织延伸到邻近的骨和牙周膜，造成牙周组织不可逆性破坏［23-24］，临床研究认为COX-2 抑制剂、非甾体抗炎药等具有较好的临床疗效［24］，但是存在副作用大的缺陷［25］。传统中草药在急性牙周炎治疗中具有疗效优势，且副作用低，然而天然中草药物多靶点、多途径的药效、方效特点阻碍了对其作用机制的深入研究，网络药理学提供了一种在系统水平方面阐释黄芩苷生物学机制的研究方法。

首先根据Lipinski 规则［26］和ADME 参数［27-28］验证黄芩苷良好的成药性。在NCBI、TCMSP、Pharmmapper、DiseaseGene Network 数据库分别获得了黄芩苷的332 个靶点及急性牙周炎的44 个靶点。进一步通过建立PPI 网络及基因映射、拓扑分析，获得了黄芩苷治疗急性牙周炎的13 个预测靶点及6 个具有拓扑重要性的靶点。富集分析结果表明黄芩苷治疗急性牙周炎主要围绕4 条核心作用通路，涉及21个BP，3个CC，2个MF。

已有研究表明，黄芩苷具有抗凋亡［29］、抗氧化［30］和抗炎作用［31］，黄芩苷治疗急性牙周炎的效应机制主要以炎症、凋亡、氧化应激为主。“Hub”节点IL-6、IL-1β、TNF、TLR4［32-34］作为4 条核心通路TNF signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway的上游启动靶点，介导与MAPK signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、JAK-STST signaling pathway 等多条通路间的复杂交互作用，如LIN等［35］研究表明NOD-like receptor signaling pathway 与MAPK signaling pathway 的交互作用在PKC 的激活［36］、诱导型一氧化氮合成［37］、炎症升高［38］中均具有重要作用。而“Hub”节点IL-6、IL-1β、TNF、Ptgs2、Mmp9 又构成了这些信号通路复杂交互作用形成的下游组分，其中IL-6、IL-1β、TNF是调控介导炎症反应的炎症因子释放的重要靶点［39］，如ZHENG等［40］认为下调IL-6、IL-1β、TNF 的表达可抑制牙周炎；Ptgs2 在炎性介质形成过程中具有重要启动作用［41］，如ZHANG 等［42］研究发现Ptgs2 启动子内DNA 甲基化水平与COX-2 的表达相关性在牙周炎疾病启动、介导中具有重要作用；Mmp9 则 具 有 重 塑 细 胞 外 基 质 的 作 用［43-44］，如BARREIROS 等［45］认为Mmp2 和Mmp9 可通过TLR2 和MyD88 参与牙周炎疾病进展。本研究结果表明，黄芩苷主要靶向作用于多条炎症、凋亡等相关的信号通路上游启动信号IL-6、IL-1β、TNF、TLR4，及下游功能信号IL-6、IL-1β、TNF、Ptgs2、Mmp9，通过4条核心通路TNF signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway及MAPK signaling pathway 等多条相关通路间的复杂交互作用，实现治疗急性牙周炎的抗炎、抗凋亡和抗氧化应激等作用。