HPLC法测定苡仁清痹浓缩丸中盐酸小檗碱的含量

蔡建峰,杨真真,邹福贤,周晓兰

(泉州市正骨医院药学部, 福建 泉州 362000)

苡仁清痹丸来源于泉州市正骨医院的临床验方,主要由黄柏、苍术、川牛膝、薏苡仁、黄芩、炒白术、木瓜、当归、鸡血藤、车前子、茯苓、红花、泽泻、陈皮和木豆叶等中药组成,该方以四妙丸为核心,辅以黄芩、车前子等清热利湿；茯苓、陈皮和泽泻利水；红花、当归、白芍和赤芍等通经止痛；鸡血藤和木瓜舒经活络,全方具有清热利湿、通络止痛的作用,在临床上疗效确切,常用于湿热蕴结型相关疾病,如股骨头坏死、骨性关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎等的治疗[1],以往研究通过中医辨证论治将股骨头缺血性坏死分为湿热内阻型、气滞血瘀型和肝肾亏虚型三种,并对其中100多例湿热内阻型患者并采用苡仁清痹丸进行治疗股骨头缺血性坏死,总有效率达94.58%,效果显著[2]。本方长期运用于临床,安全性好,疗效较佳,作用机制清楚,具有较高的开发价值,其中“苍术-黄柏-薏苡仁”为治疗风湿病的核心药组[3],也为本方的重要组成部分,现代药理研究表明其能够通过多种有效成分、多个靶点以及一氧化氮生物合成和炎症反应等多条通路的协同机制进行治疗痛风和类风湿关节炎等疾病[4-5]。

泉州市正骨医院是一家拥有推拿科、骨科、软伤科、康复科和制剂室等30多个科室的三级甲等骨伤专科医院,其制剂室始创于1962年,为集医疗、教学、科研一体的药学科室,目前生产的剂型主要有丸、散、膏、搽和酒剂等传统剂型,设备设施完善,是泉州市唯一一家具有中医特色中药制剂室,并拥有《制剂许可证》的医疗机构。苡仁清痹丸(浓缩丸)目前已完成制剂工艺研发[1],但缺乏相应的质量控制标准,不利于稳定生产和保障产品质量。高效液相色谱仪是《中国药典》中最常用的检测仪器之一,在质量控制方面运用非常广泛,如HPLC用于疏风愈痛丸和理气舒心片等中成药的质量控制[6-7]。根据2020版《中国药典》,在苡仁清痹丸(浓缩丸)的药物组成中含有HPLC含量测定项的共有13味,指标性成分含量限定较高(超过1%)的有黄芩、陈皮、红花、黄柏、赤芍和白芍等[8],其中黄柏为组方中的核心药物,对于组方发挥疗效具有重要作用。现代药理研究表明小檗碱能缓解痛风性关节炎症状,抑制炎症反应,其机制可能与炎症因子和NLRP3/TLRs信号通路有关[9-10]。而四妙丸在2020版《中国药典》中,检测指标同样为盐酸小檗碱,因此本实验确定检测对象为盐酸小檗碱,其成分含量较高,易于检出,也为组方中有效成分之一,具有代表性。

因此本文拟通过高效液相色谱对苡仁清痹丸(浓缩丸)中的小檗碱成分进行含量测定,为苡仁清痹丸(浓缩丸)的质量控制提供实验基础,将有利于保障大批量生产时的质量稳定,提高临床疗效。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100(Agilent有限公司)；PX225DZH电子天平(Ohuas有限公司)；Millipore超纯水仪(Millipore有限公司)。

1.2 试药

苡仁清痹丸(浓缩丸)(泉州市正骨医院药学部实验室制备,批号：20210601,20210602,20210603)；盐酸小檗碱(中检院,批号110713-201814)；乙腈和甲醇均为色谱纯,购自国药集团试剂有限公司；磷酸购自阿拉丁股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 方法2.1 色谱条件

采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸水(1∶3)；检测波长345 nm；进样量20μL；流速1.0 mL/min；柱温30℃；等度洗脱25 min。

2.2 对照品溶液制备

精密称取对照品5.0 mg置于25 mL容量瓶中,加甲醇超声溶解后定容,制得浓度为200μg/mL的对照品溶液。分别精密量吸取对照品溶液0.5、1、2、5、10 mL,置于10 mL容量瓶中,甲醇定容,摇匀,得浓度为10、20、40、100、200μg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取本品1.0 g粉末(过三号筛),置具塞锥形瓶中,加入70%甲醇50 mL,超声60min,放冷,用70%甲醇补足减失重,摇匀,0.45μm滤膜滤过,即得供试品溶液。

2.4 阴性供试品制备

按处方比例称取除黄柏外的其他药物后按苡仁清痹丸(浓缩丸)制法制成阴性制剂,再按照2.3项下方法制备阴性供试品溶液。

2.5 专属性试验

精密吸取上述各溶液20μL,按2.1项下色谱条件进样。结果表明,苡仁清痹丸(浓缩丸)供试品溶液与对照品溶液在相同保留时间处均有较大吸收,与相邻成分达到基线分离,阴性溶液中无干扰。结果见图1。

图1 HPLC色谱图A:对照品HPLC，图谱B:供试品HPLC图谱，C:阴性溶液HPLC图谱；1:盐酸小檗碱

2.6 线性关系考察

将2.2项下不同浓度对照品,按照2.1项下的色谱条件测定,以浓度(X)-峰面积(Y),绘制标准曲线,得回归方程为：Y=22.258X-9.6167(r=0.9999),表明在10～200g/mL范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验

取浓度为40μg/mL的对照品溶液20μL,按照2.1项下色谱条件平行进样6次,测定峰面积,结果RSD为0.94%(n=6),表明精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批次苡仁清痹丸(浓缩丸),按照2.3项下方法,制备6份供试品溶液,按照2.1项下色谱条件测定,根据2.6项下回归方程计算含量及其RSD,结果RSD为1.19%(n=6),表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

取同一份2.3项下供试品溶液分别于0、1、2、4、6、8、12、24h按照2.1项下色谱条件进样,测定相应峰面积,计算含量,结果盐酸小檗碱RSD为0.45%,表明样品稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

取同一批样品6份,每份0.5 g,分别精密加入1.1 mg对照品,按2.3项制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进样分析,计算回收率,结果平均加样回收率为98.16%,RSD为1.73%(n=6),表明本法具有良好的回收率。结果见表1。

表1 加样回收率测定结果(n=6)

2.11 结果

取3批苡仁清痹丸(浓缩丸)样品制备为供试品溶液,按2.1项下色谱条件进行含量测定,根据2.6项下回归方程计算含量,结果3批苡仁清痹丸(浓缩丸)中盐酸小檗碱分别为2.20 mg/g(批号：20210601)、2.10 mg/g(批号：20210602)、2.21 mg/g(批号：20210603)。因此暂定苡仁清痹丸(浓缩丸)每1 g含黄柏以盐酸小檗碱计,不得少于2.0 mg。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

通过对盐酸小檗碱标准品溶液进行紫外扫描,可见345 nm、263 nm和227 nm处均有波峰,吸收均较大,但是结合样品,发现在345 nm处干扰最小。有机相通过比较乙腈和甲醇,发现乙腈作为有机相,洗脱能力更强,使得图谱噪音更低,峰型更为对称[11]。关于水相,考察酸性对其的影响,发现加入酸水后,盐酸小檗碱峰型更为尖锐,减少脱位情况,而其中又以0.1%磷酸水效果最好。考察了30、35、40℃不同柱温时对样品峰形、保留时间、分离度的影响,发现温度对于目标峰的影响较小,均能较好的得到测定结果,出于节约能源考虑,最终选择30℃作为柱温。不同品牌的色谱柱具有细微的差别,通过比较Diamonsil C18和Ultimate XB-C18色谱柱,发现两者在色谱峰型上具体较小的差别,相比较来说Diamonsil C18所得到的峰型更好,更适合本实验样品,有利于计算出样品的真实含量。因此本试验选择了乙腈-0.1%磷酸水作为流动相,采用Diamonsil C18色谱柱,柱温30℃,检测波长345 nm为本次实验色谱条件。

3.2 提取方法考察

本文对提取提取溶剂进行考察,发现甲醇的提取效果优于乙醇,提取更完全；考察比较了30%、50%、70%和90%溶剂浓度,发现70%甲醇提取率最高。对超声和回流两种提取方法比较,发现超声提取方便快速。此外对不同的超声时间进行比较,发现含量随着超声时间逐渐升高,在60 min之后含量基本趋于一致,说明在60min时提取完全。对料液比同样进行考察,分别以1∶10、1∶30、1∶50、1∶70的比例进行提取,结果表明随着料液比的增加,提取逐渐充分,并在1∶50达到平台期。因此选择料液比1∶50进行提取。综合各种因素,最终选择采用50倍量的70%甲醇超声60 min进行盐酸小檗碱提取。

综上所述,本试验建立了一种采用高效液相色谱法测定苡仁清痹丸(浓缩丸)中的盐酸小檗碱的含量的方法；采用50倍量的70%甲醇超声60 min进行提取,以乙腈-0.1%磷酸水作为流动相,Diamonsil C18色谱柱,柱温30℃,检测波长345 nm为色谱条件,其方法学验证均符合相关标准,可用于苡仁清痹丸(浓缩丸)半成品和成品中盐酸小檗碱的含量测定。该方法简便、准确、快速,为准确地评价苡仁清痹丸(浓缩丸)的质量提供实验依据,有利于苡仁清痹丸(浓缩丸)的稳定生产,减少质量参差不齐的情况,从而更好的为临床服务,保障临床疗效。