宁都黄公鸡不同冠型组织学及BMP2 表达定位研究

贡继尚，周 敏*

（1.南昌师范学院，江西南昌 330032；2.江西省地方鸡种遗传改良重点实验室，江西南昌 330032；3.中国科学院家禽分子育种技术联合实验室，江西南昌 330032）

鸡冠是家禽繁殖中重要的表型性状之一，经过长期高度自然选择，产生多种冠型[1]。鸡冠表型与生产性能具有较密切的关联性，且鸡冠发育也是衡量性成熟程度的指标[2]。因此，鸡冠表型是家禽遗传选育及繁殖育种的重要指标之一。BMP2基因是转化生长因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族的成员之一，具有调控细胞增殖分化、凋亡、迁移以及胚胎发育和维持组织稳态的作用[3]。目前该基因在鸡冠发育过程中的作用逐渐被发现。Johnsson 等[4]发现BMP2和羟基酸氧化酶1（Hydroxyacid Oxidase 1，HAO1）的基因间区域有一个紧密连锁的多效性QTL，并共同影响着鸡冠发育与骨骼沉积。王琨等[5]通过高通量测序及对候选基因的表达分析认为鸡冠的发育与BMP2具有一定的关联，通过分析不同周龄的鸡冠中BMP2的表达，发现其对鸡冠发育具有调控作用[6]，但是对于性成熟的公鸡不同冠型中BMP2的表达研究还未见报道。在野生型鸡群体中，是否具有优质冠型是雌性作为选择交配的先决条件，同时也是雄性在群体中等级的标志。许多研究表明，雄性对于雌性的吸引力与子代的质量具有正相关性[7]，可能是雌性更易被较大冠型的雄性吸引，以此获得更优秀的遗传性状并传递给子代。关于鸡冠质量性状与鸡产蛋量和骨质质量等调控位点的分布都具有明显的重叠，所以研究鸡冠发育调控机制，可以间接研究家禽优质的遗传性状在遗传育种中的应用。

宁都黄鸡无论公母都具有典型的早熟性[8]，并且具有多种冠型。Mukhtar 等[9]提出16 周龄公鸡会出现性早熟现象，尤其是较大鸡冠的公鸡最明显。本研究选取16 周龄宁都黄公鸡为研究对象，通过免疫组织化学方法对6 种不同冠型的鸡冠进行表达定位分析，进一步揭示BMP2 蛋白在鸡冠不同表型中的作用，旨在为家禽的遗传改良提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物来自江西省地方鸡种遗传改良重点实验室基地（江西南师科技有限公司），为同一饲养条件下饲养的宁都黄公鸡，共17 只。

1.2 主要试剂与仪器 4% 组织细胞固定液，DAB 显色试剂盒，苏木素伊红（Hematoxylin-Eosinstaining，HE）染色试剂盒，免疫组织化学染色试剂盒（P1110，DA1010，G1120，G1120，北京索莱宝）；Anti-多克隆BMP2 抗体（GB11252，武汉塞维尔）；SLEE 半自动石蜡切片机。

1.3 实验方法 将采集的鸡冠组织置入4%组织细胞固定液中。取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 组织进行脱水、石蜡包埋和制作石蜡切片。免疫组织化学染色方法见文献[10]。

采用Image J 计算机辅助图像分析软件进行细胞计数，分别选取不同冠型免疫组化切片各3 张，每张切片随机选取5 个0.148 cm2区域，并在视野内随机选取5个比例一致的横截面，计算阳性细胞比例。

1.4 数据统计 采用SPSS 24 软件对实验数据进行单因素方差分析，相对表达水平和阳性细胞比率用X±SE（n=3）表示。P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同冠型的鸡冠发育性状 由表1 可知，倒冠和肥厚冠冠高显著高于其他冠型，肥厚冠冠长与其他冠型相比较长（P＜0.05），且细齿冠冠长与其他冠型相比较短（P＜0.05）。冠厚测量结果显示，细齿冠与其他冠型相比较短（P＜0.05），其他冠型之间冠厚差异不显著。细齿冠和齿数显著多于正常、倒冠、肥厚、三叉冠，与双叉冠差异不显著。

2.2 不同冠型组织形态学变化 通过对不同冠型的比较组织学观察（图1），细齿冠相对于其他几种冠型，外周层中小静脉较少，多为管径较小的毛细血管，血管中为单一红细胞。在正常鸡冠的外周真皮层中观察到许多构成血管内皮细胞的大和小的毛细血管。而肥厚冠、三叉冠和双叉冠的外周层中小静脉呈扩大状态，周围的真皮层大部分被扩张的血管占据，并与邻近的血管扩张吻合形成窦状血管网，血管中还观察到许多红细胞。细齿冠的外周层和中间层都比其他冠型致密，HE 染色呈深染状，梭型纤维细胞最为丰富，而其他冠型外周层由于胶原纤维网较多和成纤维细胞减少呈松散状，染色呈淡染。从图1 中观察正常冠和倒冠中间层经染色呈透明的胶原纤维组织及粘多糖，HE 染色较浅。

图1 宁都黄公鸡不同冠型组织形态比较

2.3 BMP2 在不同冠型中的表达分布 如图2 所示，BMP2 在不同冠型中均有表达，细齿冠阳性率极显著高于其他冠型，且阳性率较高（图3）。几种冠型中BMP2 均在生发层高表达，除细齿冠BMP2 阳性表达呈由深层向浅层逐渐降低趋势，其他几种冠型生发层BMP2 表达均匀，阳性表达具体体现在真皮层的血管内皮细胞及纤维细胞中。肥厚冠与双叉冠的血管管腔中有明显BMP2 阳性，但与正常冠的阳性率无显著差异。正常冠、倒冠与三叉冠中BMP2 的表达分布差异不大，但是正常冠的阳性率显著低于三叉冠与倒冠。

图2 BMP2 在不同冠型组织中表达的免疫组织化学染色结果

图3 不同冠型组织BMP2 阳性比率

3 讨 论

鸡冠作为鸡重要的表型性状之一，与繁殖和生长等性状具有重要联系[11]，可作为品种选育的重要指标之一。宁都黄鸡是江西省地方鸡种，具有早熟性状，在16 周龄就可以性成熟[8]。目前对于早熟型性状的家禽鸡冠组织学及对相关表型的研究未见报道。本研究通过对不同冠型性状进行比较组织学分析发现，除细齿冠外，其他几种冠型真皮层中小静脉形成血管网，有的形成静脉窦，管腔内红细胞数较多，这与Yoshioka[12]观察的结果一致；细齿冠外周层比其他几种冠型的薄，且有丰富的纤维细胞，而其他几种冠型外周层胶原纤维网比较疏松，尤其以正常冠与倒冠明显。与性晚熟品种青脚麻鸡26 周龄性成熟公鸡鸡冠组织相比[6]，鸡冠中都具有丰富的血管数量网，在真皮层中胶原纤维网疏松，不同的是性早熟宁都黄鸡真皮层成纤维细胞并未像青脚麻鸡一样减少，而是保持与青脚麻鸡相近的数量。性早熟品种鸡冠组织学特性兼具了性晚熟品种性成熟前成纤维细胞多和性成熟后胶原纤维疏松的特点。

BMP2 被认为是活性最强的成骨因子[13]，并可影响鸡冠的发育。王琨[5]和Liu[14]等通过转录组测序技术鉴定出BMP2参与鸡冠发育并对其进行了群体验证，发现BMP2基因在高冠和矮冠组织中差异表达，在较大群体的定量分析中发现矮冠中表达量要显著高于高冠组，本实验发现细齿冠显著低于其他冠型，并且BMP2的表达显著高于其他高冠冠型，鸡冠表面具有明显的角质层，BMP2 在矮冠中高表达具有明显的促进角化的作用，而角化过程中也存在钙化。BMP2 是成骨因素中重要的因子，对成骨细胞钙化具有重要意义，从侧面说明细齿冠BMP2 的高表达使组织逐渐趋近于角质化。相对于矮冠，高冠组织中BMP2 呈低表达，在鸡冠外周层及中心层的纤维细胞中具有少量的表达，并形成多样的高冠冠型，说明BMP2 高表达对于鸡冠的生长起到抑制作用，可形成低矮的细齿冠。推测是由于BMP2 过于集中的表达对于鸡冠的角质化过程具有促进作用，而高表达对于鸡冠分化发育方面起到了负调控作用。有实验表明BMP2 可以对牛主动脉内皮细胞的增殖及管腔形成发挥作用[15]，成熟个体的新血管形成是通过内皮细胞产生的各种蛋白酶破坏血管基底膜或其周围环境的细胞外基质而开始的，随后，血管内皮细胞进行迁移和增殖。本实验发现BMP2 在鸡冠血管内皮细胞及纤维细胞中均有表达，可能是BMP2 通过调节内皮细胞的增殖，对维持外周真皮层的血管稳态具有一定影响，这也可能是造成鸡冠膨大的因素之一。作为内皮细胞中的主要信号传导途径之一，BMP 途径十分复杂，结合的配体数量较多，功能具有多样性，会激活不同程度的细胞内信号传导并形成级联反应[16]。鸡冠属于皮肤衍生物，并且血管比较丰富，可以直接表现环境变化带来的应激，并不断产生一定的表型，这种复杂的途径对于内皮稳态以及对正常应激源和异常应激源的响应都是必不可少的。在应激过程中，BMP2 作为疏水性酸性分泌性糖蛋白[17]，通常会增加和诱导内皮的运动性和侵袭，并通过促进增殖来引起血管生成[18]。实验结果中发现血管腔中BMP2也有微量表达，这可能是由于内皮细胞中表达的BMP2通过分泌作用进入到血管腔中，作用于血管腔结构，管腔经历反复的发芽和吻合然后形成新血管网络，可能对窦状血管网的形成具有促进作用，间接对鸡冠的形成起到了塑形的影响。

4 结 论

细齿冠不同于其他冠型，真皮层中主要是以致密的纤维细胞为主，而其他冠型真皮层中生发层具有较多的窦状血管网，且外周层多胶原纤维，呈松散状。BMP2的高表达对鸡冠的分化发育具有负调控作用，且对鸡冠的血管分化具有一定影响，从而影响鸡冠组织中血管网的形成以及鸡冠多叉、高低及肥厚的表型等。本研究结果将为早熟性状家禽的遗传选育提供理论依据。