APOB在肝癌中的表达及其预后价值的研究

彭秀兰，田 山，雷长江，何安兵，罗仁峰，董卫国

1.武汉市第五医院肿瘤科，湖北 武汉 430050； 2.武汉市协和医院感染科；3.武汉市第五医院普外科； 4.江汉大学诊断教研室；5.武汉大学人民医院消化内科

肝癌是全球第六大恶性肿瘤，也是我国最常见的恶性肿瘤之一，中国最新癌症报告显示，肝癌的发病率为恶性肿瘤第4位，死亡率为肿瘤相关死亡第2位[1]。虽然近年来肝癌治疗取得了很大的进展，但手术仍然是原发性肝癌患者最佳治疗方案。然而，肝癌术后复发转移率较高，预后情况仍然不能令人满意[2]。因此，阐明肝癌的发病机制，找到经济、能够预测患者预后的临床和病理学指标显得尤为重要。

载脂蛋白主要包括载脂蛋白A1(Apolipoprotein A1，APOA1)和载脂蛋白B(Apolipoprotein B，APOB)，其在脂蛋白的代谢中发挥重要作用，可结合和运输血脂到各组织进行代谢及利用、调节酶活性、引导血浆脂蛋白同细胞表面受体结合。在肿瘤细胞异常增生代谢的过程中，会使得脂质代谢率提高，因此血脂和脂蛋白含量会相应发生变化[3]。目前普遍认为APOB是与肥胖和心血管疾病密切相关的基因，近年的研究发现APOB与多种癌症的进展及预后情况相关[4-6]。霍慧霞及Liu等[4-5]报道，APOB的基因多态性和血液中APOB的表达水平与乳腺癌的发生和转移相关。Yan等[6]研究提示，血清中APOB的表达水平可预测肝癌患者术后生存情况，但APOB在肝癌发生与发展中的作用目前仍存在争议。本研究首先分析癌症基因图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库肝癌数据集中APOB mRNA的表达以及预后分析，利用cBioportal探究APOB基因突变与肝癌患者临床病理特征及预后的相关性。此外，检测血清APOB蛋白在肝癌组织和正常组织的表达水平并探究血清APOB蛋白对肝癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集武汉大学人民医院于2015年8月至2018年8月收治的114例经手术病理确诊的肝细胞癌患者为肝癌组，选取同期来本院体检中心进行健康体检的100名正常体检者作为对照组。该项目的所有参与者均签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准纳入标准：(1)肝癌诊断标准参照《原发性肝癌诊疗规范(2011 版)》的诊断标准[3]；(2)有完整的血清 APOB、APOA1和甘油三酯检测值，其他血清学指标尽可能详细；(3)患者有准确的病理诊断结果。

排除标准：(1)肝癌复发或行二次手术的患者；(2)合并有其他恶性肿瘤的患者；(3)手术前接受放疗或化疗的患者；(4)进行APOB检测2周内服用过降血脂药物；(5)合并高脂血症患者。

1.3 APOB的测定于患者术前半个月内采用全自动生化分析仪进行检测。生化指标异常判断标准：参考《中国成人血脂异常防治指南(2016修订版)》[7]，APOB正常值参考临床检验值范围。

1.4 生物信息学分析

1.4.1 APOB基因在TCGA数据库中表达分析：APOB mRNA表达数据在TCGA数据库中(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下载。收集资料包括患者年龄、性别、肿瘤组织学分级、肿瘤浸润深度(T)分期、淋巴结(N)分期、转移(M)分期、TNM分期、总生存期和无复发生存期肝癌数据进行基因表达分析。运用Oncomine数据库(https://www.oncomine.org)分析APOB mRNA 水平在肝癌组织与癌旁肝组织表达的差异性；利用Kaplan Meier Plotter在线网站(http://kmplot.com /analysis/)探究APOB mRNA在肝癌患者预后中的价值。

1.4.2 APOB基因突变与肝癌临床特征分析：采用cBioportal分析工具(http://www.cbioportal.org/)对TCGA数据库中APOB的基因改变频率进行分析，探究APOB基因突变与年龄、T分期和TNM分期的关联，并作预后分析(总生存期和无复发生存期)。

2 结果

2.1 APOB mRNA 在肝癌组织与癌旁组织的表达水平及其诊断价值分析TCGA肝癌队列中APOB表达情况，结果显示，APOB mRNA在373例肝癌组织(16.60±0.085)中的表达显著低于50例癌旁组织(17.83±0.062)(P< 0.001，见图1A)。GEO数据库GSE14520数据集中225例肝癌组织APOB mRNA水平(12.74±0.05)也低于220例癌旁组织(13.0±0.02)(P<0.0001，见图1B)。以上结果证实APOB在肝癌组织中表达降低。TCGA-LIHC数据集中APOB mRNA可以作为诊断肝癌的标志物(AUC=0.87，见图1C)，当最佳截断值为17.58时，APOB mRNA对诊断肝癌的灵敏度为81.77%，特异度为80%。而对GSE14520的APOB mRNA数据进行ROC分析，结果表明APOB mRNA在GSE14520数据集中对肝癌也具有较好的诊断价值(AUC=0.64，见图1D)，当最佳截断值为13.1时，APOB mRNA对诊断肝癌的灵敏度为63.11%，特异度为60% 。

注：A：TCGA-LIHC数据集中肝癌组织和癌旁组织APOB mRNA表达水平；B：GSE14520数据集中肝癌组织和癌旁组织APOB mRNA表达水平；C：TCGA-LIHC数据集中APOB mRNA对肝癌的诊断价值；D：GSE14520数据集中APOB mRNA对肝癌的诊断价值

2.2 APOB mRNA与肝癌临床病理参数的相关性及患者预后分析对影响APOB mRNA的临床病理因素分析结果显示，病毒性肝炎(P=0.046)、T分期(P=0.018)、G分期(P=0.02)和TNM分期(P=0.024)能够影响APOB mRNA的表达(见图2)。进一步分析APOB mRNA的表达与患者预后相关性，结果显示，高表达APOB mRNA的肝癌患者总生存期长于低表达APOB mRNA的患者(HR=0.5，95%CI: 0.35～0.7,P<0.0001，见图3A)，高表达APOB mRNA的肝癌患者无复发生存期长于低表达APOB mRNA患者(HR=0.62, 95%CI:0.44～0.89，P=0.0076，见图3B)。

图2 APOB mRNA与肝癌患者临床病理参数的相关性分析

图3 APOB mRNA水平与肝癌患者预后分析 A：高表达APOB mRNA的肝癌患者总体生存期长于低表达APOB mRNA的患者；B：高表达APOB mRNA的肝癌患者无复发生存期长于低表达APOB mRNA的患者

2.3 APOB基因突变与肝癌患者临床特征及预后的相关性通过cBioportal网站分析APOB基因突变显示，355例肝癌患者有47例发生基因突变，总体基因突变率为13.24%，变异10.42%(37例)，扩增2.25%(8例)，深度缺失0.28%(1例)，多位点突变0.28%(1例)(见图4A)。APOB基因突变的患者年龄低于未突变的肝癌患者(P=0.004，见图4B)，突变的肝癌患者T分期晚于未突变的患者(P=0.0148，见图4C)，突变的肝癌患者TNM分期晚于未突变的患者(P=0.0206，见图4D)。预后分析表明，无APOB基因突变的患者总生存期长于突变的患者(P=0.0778，见图5A)，且无APOB基因突变的患者无复发生存期长于突变的患者，但差异无统计学意义(P>0.05)(见图5B)，可能与突变组例数较少有关。

图4 APOB基因突变与临床特征的相关性 A：13.24%的肝癌患者存在APOB基因位点的突变；B：APOB基因突变的患者年龄低于未突变的肝癌患者；C：突变的肝癌患者T分期晚于未突变的患者；D：突变的肝癌患者TNM分期晚于未突变的患者

图5 APOB基因突变与肝癌患者预后的相关性 A：无APOB基因突变的患者总生存期长于突变的患者；B：无APOB基因突变的患者无复发生存期优于突变的患者

2.4 APOB 蛋白在肝癌患者与正常体检者的表达水平及其鉴别诊断价值114例肝癌患者和100名健康体检者血清中APOB蛋白表达水平分析结果表明，肝癌患者APOB蛋白水平显著低于健康体检者[(0.77±0.02)g/Lvs(0.86±0.022)g/L，P=0.0049，Cut-off<0.805，灵敏度=62.28%，特异度=61.00%，见图6A]，血清中APOB蛋白对诊断肝癌具有一定的价值(AUC=0.60，见图6B)。APOB的表达与与肿瘤分化程度(P=0.021)、AFP表达水平相关(P=0.029，见表1)。

表1 APOB蛋白表达与临床特征的相关性

图6 APOB 蛋白在肝癌与健康体检者的表达水平及其鉴别诊断价值 A：肝癌患者APOB蛋白水平显著低于健康体检者；B：APOB蛋白对肝癌的诊断价值

3 讨论

研究显示，血清APOA1是肝癌患者的独立预后指标，且低水平的APOA1与肝癌患者的不良预后相关，血清中APOB/APOA-I比值升高是结直肠癌预后不良的独立预测因素[8-9]。血清中APOB水平与肥胖、心血管疾病、高脂蛋白血症、脂肪吸收不良、眼科疾病、恶性肿瘤等密切相关。本研究结果显示，与对照组相比，肝癌组患者APOB mRNA表达和血清APOB蛋白水平明显降低，提示肝癌患者脂蛋白含量存在异常。

Lee等[10]的基因组数据分析表明，APOB可能在调节参与肝癌发生发展的多种基因中发挥重要的作用，使用siRNA沉默表达肝癌细胞中的APOB后癌细胞增殖与侵袭能力显著加强，提示APOB的沉默表达与肝癌患者不良的临床结果和癌细胞的增殖情况显著相关。Yan等[6]报道，血清APOB水平较低的患者术后中位生存时间较长(20.33个月vs11.16个月)，血清APOB水平是肝癌患者独立预后指标，且术前APOB水平较高的患者术后生存情况较差。李仲等[11]的研究表明，术前APOB≥0.90 g/L时，其平均生存期为936 d，显著长于术前APOB<0.90 g/L患者(P<0.05)，有淋巴结转移患者的APOB水平低于无淋巴结转移患者，APOB为胃癌患者预后的独立危险因素。石璟等[12]报道，乳腺癌患者血清中APOB明显低于正常人，血清中高APOB水平可能是乳腺癌发生的保护因素。Lin等[13]表明，APOB不是肝癌发展的独立危险因素。本研究结果提示，肝癌组患者APOB mRNA表达和血清APOB蛋白水平明显降低，APOB表达水平与肿瘤分化程度、AFP表达水平相关，APOB mRNA可以作为诊断肝癌的标志物(AUC=0.87)且具有较好的诊断价值(AUC=0.64)，血清中APOB水平亦可作为肝癌的诊断标志物。预后分析表明，高表达APOB mRNA的肝癌患者总生存期长于低表达APOB mRNA的患者(HR=0.5，P<0.0001)，无复发生存期长于低表达APOB mRNA的患者(HR=0.62，P=0.0076)。

TCGA项目发现，肝癌突变基因图谱中除了熟知的原癌基因和抑癌基因，白蛋白和APOB基因亦发生频繁的突变，表明它们可能在肝癌的发生和发展中发挥着重要的作用[14]。Schonfeld报道家族性低β脂蛋白血症患者存在APOB的致病性基因突变，其血清中低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇降低，且由APOB基因突变导致的家族性低β脂蛋白血症患者更易发生脂肪肝、肝硬化和肝癌[15-16]。我们通过cBioportal分析APOB基因突变显示，APOB基因突变的患者年龄低于未突变的肝癌患者(P=0.004)，T分期晚于未突变的患者(P=0.0148，)，TNM分期晚于未突变的患者(P=0.0206)。预后分析显示，无APOB基因突变的患者总体生存期长于突变的患者(P=0.0778)，两者之间无复发生存期比较，差异无统计学意义。我们推测APOB基因突变与肝癌的发生发展和预后相关，存在突变的患者临床病理学特征和预后较差。

APOB基因是一肥胖相关基因，位于人2号染色体短臂上，全长43 kb，由29个外显子和28个内含子组成，参与体内脂质的代谢，是低密度脂蛋白的主要蛋白质成分[17]。APOB基因主要特异性表达在人类的肝脏和小肠组织，肝脏合成APOB100，小肠产生APOB48，然而APOB48脂蛋白从血浆中快速清除，不转化为低密度脂蛋白，因此常用APOB表示血清中APOB100[18]。APOB与甘油三酯、胆固醇、磷脂蛋白共同生成极低密度脂蛋白颗粒。极低密度脂蛋白从肝脏分泌后，脂蛋白脂肪酶将脂蛋白中的甘油三酯水解生成中间密度脂蛋白，最终生成低密度脂蛋白颗粒。低密度脂蛋白通过在其表面APOB与低密度脂蛋白受体结合，而APOB则分解为肝脏中的氨基酸。APOB在肝脏中合成并在肝脏中降解，血清中APOB的含量不仅与肝脏合成速度有关，而且与降解速度有关，本研究结果与Yan等[6]的报道不一致，推测可能与除肝癌组织外，残余的肝功能还可能影响肝癌患者的预后有关，尚需进一步的研究来证实。

综上所述，肝癌患者癌组织APOB mRNA和血清APOB水平异常，且与患者的临床病理学特征和预后有关。检测肝癌患者血清APOB水平有助于预测患者的预后。