lncRNA H19通过MACC1/MET/EGFR途径逆转胰腺癌细胞迁移和侵袭的研究

王 林，易基群，李 理，江高峰

1.广州市红十字会医院，暨南大学医学院附属广州红十字会医院肿瘤科，广东 广州 510220； 2.武汉科技大学天佑医院转化医学中心

胰腺癌是消化道恶性肿瘤，被称为“癌中之王”，一般出现症状时已属晚期并发生远处转移[1]。因此，对胰腺癌浸润、转移机制的深入探索将有助于开发更多的治疗策略。

人类基因组中具有组编码蛋白质功能的基因不足2%，大部分基因组则不表达蛋白质，其被称为非编码RNA。其中长度超过200个碱基的非编码RNA被称为长链非编码RNA(lncRNA)[2]。近年来研究表明，lncRNA参与调控细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、分化等生物学进程，其异常表达与临床许多疾病尤其是肿瘤发生发展关系密切[3-4]。lncRNA H19作为一个典型的lncRNA，研究发现，其在多种肿瘤中表达异常，而且在不同肿瘤类型和细胞背景中，lncRNA H19发挥的作用也不尽相同，发挥致癌或抑癌的不同生物学功能[5-8]。lncRNA H19参与调控染色体重构、DNA甲基化，也可作为miRNA前体并对组蛋白进行修饰，继而参与蛋白翻译水平调控，同时影响多种基因的表达调控网络。但到目前为止，lncRNA H19在肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用仍然不完全为人所知。

结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)最初被发现是结直肠癌的转移相关基因[9]，是HGF/c-Met信号通路的一个关键调节因子，在细胞生长、侵袭、迁移等过程中发挥重要作用。随后越来越多的研究表明，MACC1不仅与结肠癌，而且与多种肿瘤如肺癌、胃癌、肝癌以及胰腺癌的发生、发展和转移密切相关[10-11]。那么它参与胰腺癌转移的机制、是否与H19调控有关现仍未完全阐明。为进一步探讨H19在胰腺癌转移中的作用，本研究通过稳定敲低H19胰腺癌细胞株，观察胰腺癌细胞侵袭、迁移、MACC1变化以及下游细胞信号通路变化，以期为胰腺癌治疗提供新的见解。

1 材料与方法

1.1 细胞培养PANC-1细胞培养于含质量浓度为100 g/L的胎牛血清(10099141C GIBCO)的RPMI-1640培养基(C11875500BT、GIBCO、Scotland、UK)中，在37 ℃和体积分数为5%的CO2条件下培养。

1.2 RNA分离与qRT-PCR将处于对数生长期的细胞经胰酶消化，离心重悬后按RiboPureTMRNA纯化试剂盒(AM1924，Invitrogen)说明提取总RNA。采用一步法qRT-PCR测定H19的表达，引物设计如下：H19-Fwd：5′-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3′；H19-Rev：5′-CTGTCCTCGCCGTCACACCG-3′；MACC1-Fwd：5′-GGCATTGTCCTGGTGTGGT-3′；MACC1-Rev：5′-CACTCCTTCACCCCTGCTATCT-3′；根据GoTaq®1-Step qRT-PCR System(A6020，Promega)试剂盒说明书配置反应体系，qRT-PCR反应条件：反转录45 ℃ 10 min；预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 45 s；溶解曲线分析按照说明书进行，共30个循环。进行相对定量分析，ΔCt=Ct(目的)-Ct(内参)，ΔCt=ΔCt(研究样本)-ΔCt(对照样本)，实验重复3次。

1.3 H19 shRNA慢病毒的构建将含有GFP报告基因的慢病毒载体LV-008(Forevergen Bio-sciences，China)用于表达靶向H19(5′-CCAACATCAAAGACACCAT-3′)和干扰对照(5′-TGGTTTACATGTCGACTAA-3′)序列的shRNA。用包装载体将LV-008-shH19质粒转染到HEK 293T细胞中。转染后72 h收集含有感染慢病毒的上清液，并通过在Beckman Coulter SW40转子(Fullerton,CA,USA)中以100 000g超速离心2 h来浓缩慢病毒，并重悬于PBS中。然后将PANC-1细胞接种在24孔板中，并在5～10 μg/ml Polybrene存在下用慢病毒感染，后用2 μg/ml嘌呤霉素筛选H19敲低细胞10～15 d。

1.4 MACC1 RNAi的构建为了敲低MACC1在细胞中的表达，合成了19 bp siRNA(正义：5′-CACCAUAGCUUGCAAAGUA-dTdT-3′，反义：5′-UACUUUGCAAGCUAUGGUG-dTdT-3′,来自Ribo公司)。对于siMACC1转染，在转染前12 h将6×105个细胞接种到6孔板中，根据标准程序使用Lipofectin 2000(11668-27，Invitrogen，USA)进行siMACC1转染细胞。

1.5 细胞迁移和侵袭测定使用在12孔板中的8 μm孔透射室进行Transwell迁移测定。无血清RPMI-1640处理过夜后，将细胞悬浮液(1×105个细胞/ml，100 μl)接种到上层中，在下层内RPMI 1640培养基，再培养12 h后，4%多聚甲醛的PBS溶液，并用Giemsa染色。最后，在光学显微镜(200倍)下计算迁移至下室的细胞。细胞侵袭测定与细胞迁移相似。Transwell膜预涂有50 μg/μl Matrigel®(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)，然后将细胞悬浮液接种到上室中，并将细胞再培养48 h，以与细胞迁移测定相同的方式计数迁移至下层细胞。

1.6 Western blotting分析将各处理组细胞重新悬浮并在裂解液(50 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1% NP-40和0.5%脱氧胆酸盐，1 mmol/L苯甲基磺酰基uoride)中裂解20 min，4 ℃。然后通过10% SDS-PAGE凝胶电泳，并转到聚二氟乙烯(PVDF)膜上。将此膜在含有5%(W/V)脱脂奶粉的TBST(0.05%吐温20)封闭1 h，并与第一抗体(1∶1 000)一起孵育2 h，然后洗涤3 h。用TBST洗涤10 min，然后与二抗(1∶5 000，NA934-100UL，Amer-sham Pharmacia Biotech)孵育1 h，TBST洗涤3次，通过增强的化学发光系统(ECL；Amersham Pharmacia Biotech)观察。使用以下抗体：抗MACC1，KLF4以及抗VEGF(ab226803、ab215036、ab32152、abcam)，GAPDH购自Santa Cruz Biotechnology(sc-47724)。结果进行半定量分析以分析蛋白质表达。

2 结果

2.1 构建稳定的H19敲低PANC-1细胞为了探索lncRNA H19与胰腺癌细胞侵袭、迁移之间的关系，通过使用慢病毒介导的RNAi技术建立了稳定的H19敲低PANC-1细胞系。筛选H19敲低细胞并通过qRT-PCR评估敲低效应。如图1所示，与Scramble细胞相比，PANC1-shRFC3细胞中H19 mRNA减少约50%(P<0.01)。

注：**P<0.05。

2.2 敲除H19增加了胰腺癌细胞的迁移和侵袭在建立H19敲低PANC-1细胞系后，我们进行Transwell迁移实验以检测敲除H19后PANC-1细胞的迁移活性(见图2A)。测量shH19-PANC1迁移细胞的数量，结果显示H19的敲低增加了迁移细胞数量。此外，继续对细胞侵袭进行研究，如图2B所示，与对照组相比，当H19被敲低时，迁移细胞的数量显著增加至约2倍。总之，这些结果表明，H19在胰腺癌侵袭、转移过程中起抑制作用。

注：**P<0.05，***P<0.001。

2.3 敲除H19导致MACC1上调为了进一步揭示H19调节PANC-1细胞侵袭的机制，我们通过qRT-PCR和Western blotting分析shH19-PANC1细胞中MACC1的表达。结果表明，shH19-PANC1细胞中的MACC1 mRNA和蛋白质水平明显上调(见图3)。

注：***P<0.01。

2.4 敲低MACC1下调胰腺癌细胞的迁移能力为了探索敲低H19增加PANC-1细胞迁移能力上调是否与上调MACC1有关，我们进一步在shH19-PANC1细胞中敲低MACC1(见图4A)，并且进行Transwell测定(见图4B)，结果显示，敲低MACC1可以明显抑制shH19-PANC1细胞的迁移能力。

2.5 敲除H19导致MACC1下游信号蛋白的上调研究[12]表明，MACC1激活HGF/c-Met信号可以与EGFR协同刺激下游基因，因此，我们分析这些蛋白的表达。

如图5所示，HGF/c-Met以及EGFR均在shH19-PANC1细胞中上调。更重要的是，H19敲低后，磷酸化c-Met(p-cMet)的刺激作用明显高于未磷酸化c-Met，这表明H19的敲低不仅增加了c-Met的表达水平，而且刺激了其磷酸化水平。总之，这些结果表明，H19的敲低诱导MACC1的上调，导致下游信号蛋白的刺激和活化。

注：A：MACC1 mRNA表达情况,**P<0.05； B： PANC-1细胞的迁移能力。

图5 敲除H19上调HGF、EGFR、c-Met和p-cMet的表达

3 讨论

胰腺癌转移是其治疗失败主要原因，如更好地了解胰腺癌转移的分子机制，可能会发现更有效的治疗策略。lncRNA既可作为抑癌基因，亦可作为参与肿瘤发生的癌基因[13]。lncRNA H19在肿瘤发展中起重要作用，但其在肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用仍不清楚。在本研究中，我们发现lncRNA H19的敲低显著增加了胰腺癌细胞的迁移和侵袭。进一步的研究结果表明，lncRNA H19的敲低诱导MACC1的上调，并随后刺激HGF/c-Met以及EGFR信号传导途径的激活。

MACC1与c-Met的启动子结合以刺激其转录，随后导致HGF/c-Met信号传导途径的激活[14]。在肿瘤细胞中，c-Met激活触发了一系列参与细胞增殖和侵袭的信号网络[15]，我们的实验也证明MACC1的敲除显著降低了肿瘤的迁移和侵袭。先前的研究表明，HGF/c-Met的过度表达表明肿瘤侵袭的增加和癌症患者预后不良的迹象[16]。MACC1上的lncRNA H19部分是由于H19编码的miRNA靶向MACC1基因或其上游基因。我们结果发现，lncRNA H19的敲低导致MACC1的上调，增加MACC1可能会刺激HGF。因此，HGF结合诱导c-Met受体同源二聚化和磷酸化，并且最终导致HGF/c-Met信号传导途径的激活。

现已在多种肿瘤细胞中已经证实了c-Met和EGFR之间的相互作用[17]。活化的c-Met可正向调节表皮生长因子受体(EGFR)，激活后的EGFR进一步刺激激活下游信号蛋白。我们也发现当lncRNA H19被敲除时，EGFR的表达水平被上调，增加的HGF/c-Met信号传导与EGFR信号传导协同作用，刺激下游信号通路的激活以及肿瘤生长和转移的增加[18-19]。

总之，我们研究证实lncRNA H19的敲低增加了胰腺癌细胞的迁移和侵袭。进一步研究表明，lncRNA H19的敲低诱导了MACC1的上调，并随后刺激了HGF/c-Met以及EGFR信号通路的激活。这些结果表明lncRNA H19可能在胰腺癌侵袭、转移过程中起重要作用，有可能为胰腺癌转移的临床诊治提供新的思路。但本研究仅观察敲低H19对胰腺癌转移调控作用，与MACC1以及下游HGF/c-Met、EGFR变化。至于是否存在其他机制以及后续体内试验需进一步验证。