活体植物叶片气孔成像仪的设计与研制

周 懿,陈爱军,冷国强

(中国计量大学 计量测试工程学院,浙江 杭州 310018)

随着人类社会和各类工业的飞速发展,大量的二氧化碳被排入大气中,导致温室效应越来越严重。而将二氧化碳转化为有机物主要还是靠植物的固碳作用。气孔作为植物叶片进行气体交换的窗口,气孔的形态特征和行为动态是植物光合生理和水分生理研究的一个重要方面[1-3],植物在其生长发育过程中,其各种重要的生理生化活动都与气孔运动息息相关,所以对植物气孔的研究显得十分重要[4],要想实现对叶片气孔的进一步研究就必须先获取叶片气孔图像。

目前,对植物叶片的气孔进行观测的手段一般都是采用渗入法、印迹法、固定法和电镜扫描法、水装片法、透明胶带法等[5-7]。以上方法存在不同程度的缺点如操作难度大、程序复杂、效率低、使用药剂多和仪器要求较高等,且上述所有方法均打断了植物叶片正常进行的生理活动。其中,渗入法、印迹法、固定法、水装片法、透明胶带法等这些采用普通生物显微镜观测气孔的方法均将植物叶片制成标本在普通生物显微镜下观察气孔,叶片已脱离植物本体,只适用于观测气孔外形轮廓,不能对气孔尺寸测量做进一步研究;而电镜扫描法等这些采用传统显微系统与机器视觉相结合的方法虽然不破坏叶片,但因需要将叶片从植株上摘下,从而无法观测气孔的正常生理活动,而且这类方法由于场地以及条件的限制无法对叶片进行长期、连续地观测;姚静远等[8]用自制电子金相显微放大系统采集活体植物叶片气孔图像,但是由于结构设计的缺陷和采用PC机显示被采集的图像,所以观测地点、时长、植物高度都受到了限制。

综上,针对目前国内外对室外活体植物叶片气孔的观测方法和仪器的不足,我们采用自制金相显微系统将叶片气孔放大后,再通过嵌入式系统进行叶片气孔图像的采集和存储。供电系统利用太阳能电池板与铅蓄电池相结合的方式,能够实现室外连续、长时间对叶片进行观测。

1 仪器结构及工作原理

活体植物叶片气孔成像仪的整体结构如图1。主要由主体结构1、辅助结构2以及电源系统3组成。

图1 仪器整体结构示意图Figure 1 Schematic diagram of the overall structure of the instrument

由于叶片的气孔位于叶片背面,在不影响叶片正常生理活动的情况下将叶片利用夹具固定,显微镜头朝上并利用紧固旋钮固定在立柱上,采集到叶片气孔的图像信息后,通过光纤传像束发送到辅助结构中,辅助结构对光纤传像束传送的图像信息进行提取后进行图像文件的保存。利用太阳能以及蓄电池组成的供电系统对整个系统进行能源供应,可实现户外长期观测工作。

为满足实际使用需求,对活体植物叶片气孔成像仪的设计指标主要定为如下几个方面:

1)装置系统放大倍率不小于300倍;

2)显微物镜视场观测范围不小于160 μm×120 μm;

3)装置可拆卸、易组装;

4)植物叶片观测高度不小于2 m;

5)装置分辨力为1 μm。

2 总体方案设计

本仪器选用STM32F103ZET6芯片作为MCU,配合晶振时钟电路、JTAG接口以及复位电路等形成最小系统。仪器的设计主要分为硬件和软件。硬件的设计包括仪器机械结构设计、光学系统设计以及控制电路的设计等;软件设计主要是图像采集程序的设计。具体结构框图如图2。

图2 活体植物叶片气孔成像仪结构框图Figure 2 Structure block diagram of live plant leaf stomata imager

3 硬件设计

硬件设计部分包括机械结构、光学系统以及控制电路三个部分。

3.1 机械结构

为满足设计指标中提出的可观察2 m高度的叶片的要求,且保证满足可拆卸、易组装的要求,机械设计选型时尽量选取现有标准件,一方面可缩短仪器研制周期,另一方面有利于更换、维修机械部件。机械结构的主要组成如图3。

图3 机械结构框图Figure 3 Mechanical structure block diagram

由于植物叶片表面气孔尺寸不一,通常在6～25 μm之间,需在高倍显微系统下观察[9]。植物叶片气孔主要分布在叶背,叶绿素主要分布在叶面[10],故需要将显微系统倒立以进行叶片气孔的观测。此外植物叶片有一定的透光性,不同种类植物的叶片透光强度不同,且透光的强弱随着外界自然光的增强而增加。由于金相显微系统的照明方式为同轴照明,所以叶片的透光性会影响采集图像的像质;为消除这一影响,在对气孔图像信息进行采集之前,通过安装在被测叶片上方,由舵机进行控制的遮光板来完成遮挡外界光源干扰的任务,而这一过程只需要3 s左右的时间,不影响叶片气孔的生理活动。

3.2 光学系统

为了能够顺利采集所需的图像信息,需要利用光学系统将叶片气孔进行放大,便于嵌入式系统的图像采集。光学系统主要由金相显微系统、调焦系统组成。

3.2.1 金相显微系统

金相显微系统主要由金相物镜、同轴照明器、中继透镜、调焦系统、CMOS摄像头、机械外壳组成。加入的放大倍率为1倍的中继透镜保证成像质量,同轴照明器保证光源充足。图4为金相显微系统光路传输示意图。

图4 光路传输示意图Figure 4 Schematic diagram of optical transmission

金相物镜的倍率根据使用需求选用,而显微物镜与中继透镜之间的参数可通过相应的设计手册中推荐选用。根据手册中的推荐可确定中继透镜距离像端面尺寸为151.2 mm,中继透镜与金相显微物镜之间的距离在100～200 mm之间,为减小系统的体积,将金相显微物镜与中继透镜之间的距离固定为最小值即100 mm,考虑到安装误差等问题,应留有一定的裕量,所以最终距离确定为103 mm。图5为设计加工完毕后的金相显微系统光学系统实物图。为防止外界光源、灰尘进入金相显微系统内,须增加机械外壳予以保护,此外为减小机械外壳内壁有杂光反射,内壁均做发黑处理。光学系统与转接件连接,再通过转接件上的紧固旋钮固定在主体仪器三脚架上的延长杆上。

图5 光学系统实物图Figure 5 Picture of the optical system

3.2.2 调焦系统

调焦系统由叶片夹具、微调焦机构组成。在观察过程中为防止叶片脱离植物体,设计了叶片夹具用于装夹固定叶片,能够最大程度上减少由于各类突发情况导致叶片脱离植株。为最大限度地减小对叶片进行正常光合作用的影响,采用压片夹将叶片固定,叶片装夹如图6。

图6 叶片装夹图Figure 6 Leaf clamping diagram

由于光学系统放大倍率较大,必须要对物镜进行调焦。微调焦机构如图7,通过粗、细调以实现叶片气孔图像的最清晰化。

图7 微调焦机构Figure 7 Fine focusing mechanism

叶片夹具与微调焦机构通过直角形紧固件连接,微调焦机构通过紧固旋钮固定在主体仪器三脚架上的延长杆上。舵机和遮光挡板固定在叶片夹具上。调焦系统与光学系统装配如图8。

注:1—遮光挡板;2—叶片夹具;3—光学系统;4—转接件;5—调焦机构图8 调焦系统与光学系统装配图Figure 8 Assembly drawing of focusing system and optical system

3.3 硬件电路系统

硬件电路结构框图如图9。散热器与温度传感器主要用于仪器机箱内部降温防止温度过高影响其正常工作;增加电压监测电路时刻监测电池状态;遮光挡板用于消除在图像采集时外界自然光的干扰;人机交互利用触摸屏实现;USB转串口用于程序调试和后期固件升级;外部SRAM用于增加软件程序内存空间;硬件看门狗预防程序出错或跑飞;TF卡用于储存UI界面功能图标和采集到的叶片气孔图像;CMOS摄像头用于采集放大后的叶片气孔图像;DS1302时钟芯片用于为系统提供时间基准,也便于为后续新建文件夹和BMP文件命名;蜂鸣器用于声音报警以及触摸提示。

图9 硬件电路结构框图Figure 9 Block diagram of the hardware circuit

硬件电路在满足仪器功能的前提下,为增强其抗干扰能力,在感性负载、铅蓄电池电压的监测与控制器之间增加光电隔离电路。

4 软件设计

仪器的软件程序基于μCOS-Ⅱ嵌入式实时操作系统进行编写,通过对任务合理划分将任务主要分为监测任务、触摸任务、APP运行任务。监测任务主要用于监测仪器当前是否处于正常状态,如程序是否正常运行、工作环境温度是否正常、蓄电池电量是否正常、更新仪器的日期、时间以及储存的气孔图像的数量等。触摸任务能够实现人机交互,通过判断用户触点执行下一步操作;在用户选择所需要执行的任务后,APP运行任务开始运行所选择的任务。该仪器程序中共设计有5个子任务,不同的图标与不同的功能相对应。为保证系统正常有序的运行,根据实际情况将各任务的优先级顺序安排如下:触摸任务优先级最高,APP运行任务次之,监测任务最低。图10为软件程序系统结构框图。

图10 软件程序系统结构框图Figure 10 Structure diagram of software system

5 气孔成像观测试验

仪器的实地测试地点选择在校园内,对校园内的香樟树、桂花树、桦树叶片气孔进行了观察。通过调节可升降三脚架高度可实现对高2 m内的叶片气孔的观察,图11为仪器实验现场。

图11 仪器实验现场Figure 11 Instrument experiment site

仪器的数字放大倍率为14倍,更换不同倍率的金相物镜可变化不同的系统放大倍率。仪器能够在不影响植物叶片正常活动的情况下对叶片背部的气孔进行图像采集。但是由于不同种类植物叶片的柔软度以及平整度存在差异,这些因素会导致观察不同植物叶片其获取的气孔图像也会存在一定的差异,即使是观察同一片叶片,其背部的平整度不一可能会导致图像局部模糊。图12为桂花树叶片气孔,图13为香樟树叶片气孔,图14为桦树叶片气孔,这些气孔图像均在系统放大倍率为280倍时获取的。

图12 桂花树叶片气孔Figure 12 Stomata of osmanthus tree leaf

图13 香樟树叶片气孔Figure 13 Stomata of Cinnamomum camphora leaf

图14 桦树叶片气孔Figure 14 Stomata of birch leaf

从图12～14中可得,叶片的清晰度较好,叶片气孔较为明显,能够实现在不影响植物叶片进行正常生理活动的情况下对叶片气孔的图像信息进行采集的功能。

6 结 语

本文设计并研制了一种可在不影响植物叶片正常生理状态下对叶片气孔图像进行采集的仪器。以STM32单片机作为MCU并辅以相应的采集电路,配合可应对各类情况的机械结构和太阳能电源,能够长时间、连续地对叶片气孔的工作状态进行观察。实验表明采集到的气孔图像效果较优,为后续通过图像计算被测叶片气孔的开度值,进一步研究气孔的活动机理奠定了基础。