扶正消积胶囊对胃癌细胞BGC-823的增殖抑制及凋亡的影响

薛刚 刘杰 许利军 石建 凌博凡

摘要 目的：研究扶正消积胶囊在体外对人胃癌细胞BGC-823增殖抑制及凋亡的影响。方法：MTT实验检测扶正消积胶囊对BGC-823细胞增殖的影响;流式细胞仪检测其对BGC-823细胞凋亡的影响;Real Time-PCR、Western blotting实验检测其凋亡相关基因表达。结果：与空白组比较，BGC-823细胞的增殖能被扶正消积胶囊显著抑制（给药24 h），此抑制率随给药剂量的增加而上升，在剂量为5 mg/ mL时，其抑制率达86.71%，且这种抑制呈剂量依赖关系。Annexin V/PI双染法联合流式细胞仪结果显示扶正消积胶囊能诱导BGC-823细胞凋亡，BGC-823细胞早期凋亡率随给药剂量的增加，在给药剂量分别为2.5 mg/mL、5 mg/mL时，BGC-823细胞早期凋亡率分别达到15.76%、38.25%;Western blotting、Real Time-PCR结果表明，Procaspase-3、9蛋白酶表达随剂量的增加而明显减小，Bcl-2、Bcl-xl、Survivin 3种基因表达随给药剂量的增加而下降，Bax基因表达则相反。结论：扶正消积胶囊能通过激活caspase级联反应抑制胃癌细胞增殖并诱导其凋亡。

关键词 扶正消积胶囊;BGC-823胃癌细胞;肿瘤;增殖;凋亡

Abstract Objective：To investigate the influence of Fuzheng Xiaoji Capsule on the proliferation inhibition of human gastric cancer cell BGC-823 and its apoptosis.Methods：Effects of Fuzheng Xiaoji Capsule on proliferation of BGC-823 cells were investigated with MTT assay.Flow cytometry was used to detect the cell apoptosis while the effect of apoptosis related gene of Fuzheng Xiaoji capsule on BGC-823 cell was measured by real time-PCR and Western blotting.Results：MTT assay showed that the BGC-823 cells were inhibited by Fuzheng Xiaoji Capsule compared with control group，after treated on 24 h.The inhibition rate increases with the increase of dose，which is dose dependent.At the dose of 5 mg/mL，the inhibition rate reached 86.71%（P<0.05）.Flow cytometry demonstrated that Fuzheng Xiaoji Capsule could induce the apoptosis of BGC-823 cells.The early apoptosis rate of BGC-823 cells increased with the dose of the drug.At the dose of 2.5 mg/mL and 5 mg/mL，respectively，the early apoptosis of BGC-823 cells reached 15.76% and 38.25% respectively.By the results of Western blotting and real time-PCR，the expression of caspase-3、caspase-9 was significantly lower as the dose increased.Also，it could reduce the activity of Bcl-2，Bcl-xl，Survivin and increase the activity of Bax.Conclusion：Fuzheng Xiaoji Capsule could inhibit the proliferation of BGC-823 cells and induce their apoptosis.The possible mechanism was through activation of caspase cascade reaction.

Keywords Fuzheng Xiaoji Capsule; BGC-823 human gastric cancer cell; Cancer; Proliferation; Apoptosis

中图分类号：R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.005

胃癌是世界范圍内最常见的恶性肿瘤之一，也是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国西北以及东部沿海地区胃癌发病率高居首位[1-3]。手术仍是目前治疗胃癌的主要手段，术后化疗在胃癌治疗中占重要地位，不良反应是大多数胃癌患者无法完成既定化疗疗程的主要原因。近年来，中医药在治疗胃癌方面取得重大进展，尤其是在改善临床症状、提高生命质量、延长生存时间等方面疗效肯定[4-5]。临床工作中，中药与化疗相结合既能提高化疗效果，亦能减轻化疗不良反应。

扶正消积胶囊为如皋市中医院院内制剂，具有益气健脾、解毒消积、活血通络、抗癌止痛之功效。多年的临床使用发现，扶正消积胶囊治疗各类肿瘤具有相当好的疗效，因而我们以胃癌细胞为目标进行实验，探讨扶正消积胶囊治疗胃癌的相关分子机制[6-7]，进一步为扶正消积胶囊临床治疗打下坚实的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人胃癌细胞株BGC-823，购买自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，培养液用1640培养液（含10%小牛血清以及1%双抗），孵箱环境：37 ℃以及含5%CO2。

1.1.2 药物 扶正消积胶囊（组成：黄芪、白花蛇舌草、水红花子、党参、生大黄、三棱、炒薏苡仁、莪术、蜈蚣、炙鳖甲、西洋参、参三七、全蝎），如皋市中医药院内制剂;苏药制字Z04001609，生产批号：100614。

1.1.3 试剂与仪器 1640培养液（Gibco公司，美国，货号：2058872）;胎牛血清（常州四季青公司，货号：22011-8612）;四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Biosharp公司，货号：BS186）;流式凋亡试剂盒（凯基公司，货号：KGA107）;逆转录试剂盒（TaKaRa公司，日本，货号：RR820A）;β-actin一抗（Sigma公司，美国，货号：MAB1501）;Caspase-3一抗（货号：SC-2375）、Caspase-9一抗（货号：SC-2146）、Bax一抗（货号：SC-2314）、Bcl-2一抗（货号：SC-2319），以上购自美国Santa cruz公司;山羊抗鼠二抗（货号：20180515）、山羊抗兔二抗（货号：20180536），以上购自北京中杉生物技术公司;全自动酶标仪（BioTek公司，美国，型号：00099192）;超速离心机（型号：ZCKP20181200100019）、流式细胞仪（型号：ZCKP020200300100413）、ABI荧光定量PCR仪（型号：ZCKP0201301001001331）、伯乐凝胶成像仪（型号：ZCKP020130100100132），以上购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT实验 将细胞接种于96孔板，每孔8×103个细胞，培育12 h，待细胞贴壁后，观察组给予扶正消积胶囊，根据预实验结果，选择剂量依次为5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL，0.625 mg/mL;另设1个阴性对照组，含1‰DMSO的1640培养液，对照组不加任何药物，培养24 h后，向96孔中每孔加入120 μL 1640培养液，其中含MTT 20 μL，培养箱中培育4 h后，弃上清液，酶标仪490 nm波长测量96孔板每孔的吸光值，计算扶正消积胶囊对BGC-823细胞增殖的抑制率，抑制率=（1-观察组/对照组）×100%，实验重复3次，取3次结果的平均值，绘制成柱状图。

1.2.2 Annexin-V/PI双染法 消化下贴壁细胞，接种于直径为6 cm的培养皿，每个培养皿3×105个细胞，放置培养箱，待细胞贴壁后给药，设2个给药组剂量分别为5 mg/ mL、2.5 mg/mL，1个5-FU阳性对照组50 μg/ mL，1个不加任何药物的空白对照组。24 h后，离心收集消化下来的细胞，每组中加入Binding Buffer 500 μL，重懸各管，向各管中加入5 μL PI以及5 μL Annexin-V，随后在暗室中避光振荡约10 min，在流式细胞仪中检测各药物剂量的胃癌细胞凋亡情况。

1.2.3 RT-PCR实验 消化下贴壁细胞，接种于直径为6 cm的培养皿，给药方法同上，24 h后，提取各剂量组细胞总RNA，紫外分光光度计计算出所提取RNA质量，经TaKaRa RT逆转录试剂盒进行逆转录，逆转录完成后，根据Primer Premier 3.0软件分别设计PCR引物。见表1。随后进行聚合酶链式反应（PCR）。将PCR Forward Primer（10 μmol/L）、Power SYBR Green（2×）、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、dH2O体系混合，7500Fast PCR仪行扩增反应，先是预变性：95 ℃ 30 s，循环1次;然后PCR：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环40次，最后进行融解曲线分析：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，循环1次，实验中设置3个复孔，提炼出不同标本Ct值。公式△Ct=目的基因Ct值-内参照基因Ct值（内参为β-actin），△△Ct=观察组△Ct-对照组△Ct，得出各剂量组标本RQ值（RQ=2-△△Ct）。结果绘制成柱状图。实验重复3次，取3次实验平均值。

1.2.4 Western Blotting实验 将消化下来的胃癌细胞接种于直径为10 cm的培养皿，给药方法同上，给药24 h后，提取各组剂量相关蛋白，随后用Bradford法进行蛋白剂量测量，不同剂量组各取20 μg蛋白经SDS PAGE分离后转到PVDF膜上，转膜结束后，有蛋白一面向上放入预先配制好的5%牛奶封闭液中封闭1 h，再向塑封膜里加入一抗，放置于4 ℃冰箱过夜，次日取出PVDF膜，滤纸贴角稍吸干，PBST溶液洗去一抗，加入二抗，室温孵育1 h后，同上洗去二抗，向PVDF膜上滴入ECL液，予暗室中进行发光，最后得出Western Blotting条带。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，各组两两比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扶正消积胶囊对人胃癌细胞BGC-823的增殖抑制 经MTT实验检测，结果显示不同剂量的扶正消积胶囊作用于BGC-823细胞24 h后，在剂量为5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL时，其对BGC-823细胞抑制率分别达到（86.71±4.2）%，（68.44±5.3）%，（43.16±3.8）%，（25.63±2.9）%。见图1。与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果亦显示，扶正消积胶囊对BGC-823细胞的增殖抑制率随着给药剂量的增加而增加，在剂量为5 mg/mL时，其对BGC-823细胞增殖抑制率达到一个峰值，呈剂量依赖关系。

2.2 扶正消积胶囊对人胃癌细胞BGC-823凋亡的影响 通过MTT试验，我们检测出不同剂量扶正消积胶囊作用胃癌细胞BGC-823 24 h的抑制率，据此，我们选用一个高剂量5 mg/mL、中剂量2.5 mg/mL以及用常见的化疗药物5-FU作为阳性对照组作为检测药物剂量，流式细胞仪检测细胞早期凋亡结果示：扶正消积胶囊在作用于人胃癌细胞BGC-823 24 h后，BGC-823细胞早期凋亡率随着给药剂量的增加，从6.12%增加到15.76%、38.25%（P<0.05），而5-FU阳性对照组早期凋亡为14.43%，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 扶正消积胶囊对于胃癌细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响 RT-PCR实验结果表明，扶正消积胶囊作用于人胃癌细胞BGC-823 24 h后，Bcl-2、Bcl-xl、Survivin mRNA的表达随剂量的上升而下降，Bax mRNA的表达则相反，表明扶正消积胶囊能下调Bcl-2、Bcl-xl、Survivin mRNA的表达，上调Bax mRNA的表达。见表2。

2.4 扶正消积胶囊对胃癌细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响 Western Blotting实验结果表明，通过流式细胞仪检测扶正消积胶囊对BGC-823细胞早期凋亡，结果显示扶正消积胶囊能诱导人胃癌细胞凋亡，据此，运用Western Blotting实验探讨其诱导细胞凋亡的分子机制。在给药24 h后，与对照组比较，5 mg/mL、2.5 mg/mL剂量组Procaspase-3、9蛋白酶表达量随给药剂量的增加而明显减小，Bax蛋白条带表达量随着给药剂量的上升明显增高，Bcl-2蛋白表达则相反。根据实验结果可以得出，扶正消积胶囊其能激活Caspase-3、9活性以及上调Bax蛋白表达下调Bcl-2蛋白表达，从而引起BGC-823细胞凋亡。见图3、图4。

3 讨论

细胞凋亡是一种受基因调节的自主调控过程，在肿瘤的个体发育以及发病机制中有着非常重要的作用，过度增殖加上细胞凋亡程序的紊乱，是导致恶性肿瘤产生的主要原因[8]。探索肿瘤发病的机制以及寻找有效治疗肿瘤的方法是现代医学研究的热点。根据肿瘤细胞凋亡机制，目前治疗肿瘤有效的方法之一则是通过促进细胞凋亡过程的再启动，因而目前很多学者重点研究肿瘤细胞凋亡信号通路的调控机制。根据凋亡信号的来源认为细胞凋亡是受细胞内外因子调控的[9-10]：外在的死亡受体介导通路;内在线粒体介导的内源性通路以及内质网应激（ERS）介导的凋亡通路。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节，在多种癌细胞如胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌等发现该基因的都存在异常表达[11-14]。作为最重要的细胞凋亡途径执行因子之一，Caspase-3蛋白通过上游的启动因子Caspase蛋白酶原（Procaspase）切割特异性底物，激活下游Caspase蛋白，从而导致细胞凋亡[15-16]。此外，目前研究亦证实了凋亡基因中存在非Caspase依赖的信号通路，Bcl-2家族蛋白就是其中一员[17-18]。根据结构以及功能不同将其家族成员分为促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bim等）凋亡诱导因子和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bel-xL、Bcl-W等）凋亡诱导因子2种类型[19-20]。有学者研究二者之间关系发现，Bcl-2家族蛋白成员间的相互作用对Caspase-3、Caspase-9凋亡通路起调控作用[21]。据此，为研究扶正消积胶囊诱导人胃癌细胞凋亡的分子机制，我们选择探讨其对线粒体介导的内源性细胞凋亡通路（Caspase-3、Caspase-9）以及Bcl-2家族蛋白（Bax、Bcl-2）的这2种蛋白表达的影响。

“扶正消积”概念取自中医治疗疾病的思想：祛邪扶正、调节机体阴阳平衡。本实验以此为理念，探討本院院内制剂扶正消积胶囊其对胃癌细胞BGC-823凋亡表达的影响。研究发现扶正消积胶囊能抑制BGC-823细胞增殖，通过流式细胞仪联合Annexin-V/PI双染法实验结果显示，扶正消积胶囊对胃癌细胞BGC-823细胞早期凋亡率从6.12%增加到15.76%、38.25%，差异有统计学意义，呈剂量依赖关系;在基因蛋白检测方面，结果表明：Bcl-2、Bcl-xl、Survivin基因表达则下降，Bax基因蛋白的表达随着给药剂量的上升而上调;Caspase上游基因Procaspase-3、9蛋白酶表达随着剂量的增加而明显减小，这个结果表明Caspase-3、9活性成分被剪切下来，从而激活Caspase-3、9表达，导致细胞凋亡，并且呈现剂量依赖关系。

通过本次扶正消积胶囊作用于BGC-823胃癌细胞体外实验，发现扶正消积胶囊能显著抑制BGC-823胃癌细胞的增殖，诱导其凋亡;其可能机制为激活Caspase通路以及下调Bcl-2、Bcl-xl、Survivin蛋白表达，上调Bax的表达。

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（2020-03-15收稿 责任编辑：芮莉莉）