PM2.5对哮喘大鼠IL-17/IL-23炎症介质的影响及人参皂苷Rg1干预研究

周亚兵 蒋思韵 王利维 华丽

摘要 目的：基于气道IL-17/IL-23炎症介质轴，探讨人参皂苷Rg1对PM2.5哮喘大鼠肺损伤保护机制。方法：采集并分离交通相关大气细颗粒物PM2.5，利用卵白蛋白致敏和激发建立幼龄哮喘大鼠模型，再给予PM2.5气管滴注建立PM2.5哮喘肺损伤模型，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1含量，RT-PCR检测RORγt mRNA表达，并行肺组织病理和电镜分析。结果：成功建立PM2.5气管滴注哮喘大鼠模型;哮喘大鼠模型血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1表达量增大（P<0.01），肺组织RORγt mRNA表达量增加（P<0.01）;经PM2.5气管滴注后，模型组大鼠血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1含量进一步增加，RORγt mRNA表达量进一步上升（P<0.01）;经皂苷Rg1干预后，呈现剂量依赖性下调血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1水平，下调RORγt mRNA表达量。结论：人参皂苷Rg1呈剂量依赖性改善PM2.5致哮喘大鼠肺气道炎症反应、改善肺损伤。

关键词 哮喘;大气颗粒物2.5;辅助性T细胞17;白细胞介素-17;白细胞介素-23;维A酸相关孤儿受体γt;人参皂苷Rg1

Abstract Objective：Based on the airway IL-17/IL-23 inflammatory factor axis，to explore the protective mechanism of Ginsenoside Rg1 on lung injury in PM2.5 asthmatic rats.Methods：PM2.5 was isolated and sensitized by ovalbumin，and then PM2.5 was intratracheal instilled to establish PM2.5 asthmatic lung injury model.The levels of IL-17a，IL-6，IL-23 and TGF-β1 in serum and BALF were measured by ELISA.The expression of RORγt mRNA was detected by RT-PCR，and the lung tissue pathology and electron microscopy were analyzed.Results：The asthmatic rat model of PM2.5 was established successfully; The expression of IL-17a，IL-6，IL-23 and TGF-β1 in serum and BALF of asthmatic rats increased（P<0.01），and the expression of RORγt mRNA in lung tissue increased（P<0.01）; After PM2.5 intratracheal instillation，the contents of IL-17a，IL-6，IL-23 and TGF-β1 in serum and BALF of model group were further increased，and the expression of RORγt mRNA was further increased（P<0.01）;After intervention with saponin Rg1，IL-17a，IL-6，IL-23，TGF-β1 in serum and BALF were decreased in a dose-dependent manner，and RORγt mRNA expression was down regulated.Conclusion：Ginsenoside Rg1 can improve airway inflammation and lung injury induced by PM2.5 in a concentration dependent manner.

Keywords Asthma; atmospheric particulate matter 2.5; helper T cell 17; IL-17;IL-23;retinoic acid related orphan receptor γt; ginsenoside Rg1

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.004

大气颗粒物PM2.5（Particulate Matter 2.5），因其粒径小、比表面积大、组成复杂，易富集有毒有害物质，随呼吸可进入肺泡深部，甚至透过呼吸膜进入循环系统[1]。研究已证实PM2.5与呼吸、心脑血管及免疫系统的疾病关系密切，儿童机体发育尚未完善，更易受到PM2.5的危害[2-4]，导致肺组织结构损伤和功能缺陷，影响肺功能，导致儿童哮喘患病率和症状严重程度增加[5-7]。Th17作为重要炎症细胞，在多种炎症反应疾病中发挥重要作用;IL-23具有激活记忆T细胞向Th17细胞转化的功能;维A酸相关孤儿受体γt（Retinoid Acid-related Orphan Receptor Gamma t，RORγt）是Th17细胞分化的关键核因子及Th17细胞谱系特异性转录激活因子，可诱导调控IL-17高水平分泌，诱导多种细胞释放炎症介质而导致过度炎症反应，从而促进哮喘发病[8]。人参皂苷Rgl（Ginsenoside-Rgl，G-Rgl）具有抗氧化应激、抗炎症反应、抗纤维化和神经保护作用[9]，对脓毒症肺损伤有修复作用[10]，那么，皂苷Rg1对PM2.5损伤哮喘大鼠肺气道是否有修复保护作用？本实验成功建立PM2.5气管滴注亚急性损伤哮喘大鼠模型，以TH17细胞的分化和调节为主轴，探讨人参皂苷Rg1对PM2.5哮喘大鼠肺损伤保护机制，以期寻找药物作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

雄性2周龄无特定病原体（SPF）级Wistar大鼠100只，体质量（50±5）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供[合格证号SYXK（沪）2012-0002]，飼养于新华医院清洁级动物中心[SYXK（沪）2013-0031]，所有操作均严格按照中国伦理委员会有关动物研究指导原则进行。饲养于温度（22±2）℃、湿度光照12 h/12 h明暗交替环境。

1.1.2 药物 人参皂苷Rg1（Sigma公司，美国，货号：18826）。

1.1.3 试剂与仪器

鸡卵白蛋白（Sigma公司，美国，货号：A21772）;酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒，大鼠IL-17a（货号：BMS635）、IL-6（货号：ERA31RB）、IL-23（货号：ERA28RB）、IL-22（货号：ERA27RB）、转化生长因子-β1（TGF-β1）（货号：BMS623-3）、TRIzol试剂盒（货号：15596018），以上试剂盒均购自美国Invitrogen 公司。兔抗鼠抗体RORγt多克隆抗体（Takara公司，日本，货号：RR037A）;定量PCR仪及配套分析软件（Roche公司，美国，型号：96LightCycler）;大气颗粒物大流量采样器（型号：Anderson G-2.5）、酶标仪（型号：MultiskanTM FC），以上购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备与分组

1.2.1.1 大气颗粒物PM2.5制备 在市区某建筑物楼顶（高度10 m，周围无明显污染源），大流量采样器采集大气颗粒物，将吸附细颗粒物的滤膜裁剪为1 cm×3 cm大小，浸入去离子水中，超声振荡30 min×3次，洗脱细颗粒物，振荡液用6层纱布过滤，滤液在低温离心机4 ℃下10 000 r/min，离心半径8 cm，离心20 min，将浓缩上清液及底层颗粒物合并冷冻真空干燥，低温冰箱保存备用。

1.2.1.2 二步法建立PM2.5亚急性损伤哮喘大鼠模型

第1步：建立大鼠哮喘模型：雄性2周龄Wistar大鼠，适应性喂养3 d后，在第1天和第7天腹腔注射卵清蛋白（OVA）（1 mg）和氢氧化铝凝胶（50 mg）混合液共1 mL致敏;在第14天置于半透明雾化吸入箱中，超声雾化吸入1%OVA激发，30 min/次，隔天1次，连续7 d。最后1次激发24 h内记录各组模型鼠发病情况，以大鼠出现咳嗽、呼吸急促、腹肌抽搐、口唇发绀为模型成功标准。

第2步：气管滴注法建立PM2.5再损伤哮喘大鼠模型：符合哮喘标准大鼠按照随机数字表法分为4组，共72只，采用气管滴注法将PM2.5混悬液注射到支气管深部染毒，PM2.5滴注剂量为5 mg/（kg·bw），用前超声振荡5 min混匀，隔天气管滴注染毒1次，维持21 d。另设生理盐水滴注哮喘大鼠作为对照（A组）。

1.2.1.3 分组方法 将PM2.5亚急性损伤哮喘大鼠分为3组：PM2.5亚急性损伤哮喘组（A+PM组）、人参皂苷Rg1低剂量组（L-Rg组）、高剂量组（H-Rg组）。另设同龄正常对照组（N组）、哮喘组（A组），各组8只。

1.2.2 给药方法

Rg1低剂量组（PM+Rg-L组）、高剂量组（PM+Rg-H组），分别按照10 mg/kg、20 mg/kg标准连续腹腔内注射;PM2.5亚急性损伤哮喘对照组（PM+A组）、正常对照组（N组）、哮喘组（A组）予以等体积生理盐水腹腔内注射。1次/d，连续给药14 d，第15天处死采集标本。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 肺组织病理学及电子显微镜观察

最后一次给药后，水合氯醛[10%，3 mL/（kg·bw）]麻醉大鼠，取各组大鼠右肺上叶，多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片，切片厚度4～6 μm，HE染色，中性树胶封固，光镜下观察支气管、肺泡及肺泡隔炎性细胞浸润情况。另取标本用于电子显微镜观察气道上皮，肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞、肺泡间质变化。

1.2.3.2 血清TGF-β1、IL-6、IL-17a、IL-23水平测定

分离血清，采用双抗体夹心ELISA法测定，按照连续倍比稀释标准品，混捕获微球，制备细胞因子检测抗体，然后将样本与检测抗体混匀，室温避光孵育1 h，洗涤后全自动酶标仪450 nm波长处测定吸光度值（A450）并绘制标准曲线。

1.2.3.3 肺泡灌洗液IL-6、IL-17a、IL-23水平测定

左肺行肺泡灌洗液，暴露气管，剪一斜口，插入带有聚乙烯管的肺灌洗针头，结扎固定;磷酸缓冲液（PBS）按35 mL/（kg·bw）。总肺容量×0.6（右肺占总肺容量的60%）的灌洗量进行肺灌洗;同时轻轻按压胸腔，缓慢抽出气管内PBS再重新缓慢注入，如此反复灌洗3次，回抽率>85%，得到支气管肺泡灌洗液。用双抗体夹心ELISA法测定，按照连续倍比稀释标准品，然后将样本与检测抗体混匀，室温避光孵育1 h，洗涤后全自动酶标仪450 nm波长处，测定吸光度值（A450）并绘制标准曲线。

1.2.3.4 RT-PCR检测肺组织RORγt mRNA表达

右下肺组织置于冻存管中，液氮中速冻后转入-80 ℃冰箱保存，采用TRIZOL法提取肺组织总RNA，取5 μL逆转录合成cDNA，以2.5 μL cDNA为模板，分别应用各组上下游引物行PCR扩增，引物序列：RORγt上游5′-AGTGTAATGTGGCC-3′，下游5′-GCTGCTGTTGCAGTTGTTTCT-3′，以相对表达量2-△△Ct法计算目的基因相对表达量，采用Roche软件分析RT-PCR条带平均灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料使用均数±标准差（±s），多组间比较采用方差分析（方差齐性），多组间两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

经卵蛋白致敏激发后，哮喘组（A组）大鼠均出现喘息、呼吸急促、点头呼吸、弓背、前肢缩抬等哮喘症状。经PM 2.5气道滴注后，PM+A组喘息、呼吸急促、点头呼吸、弓背、前肢缩抬等症状更加明显。经人参皂苷Rg1干预后，人参皂苷Rg1低、高剂量组（PM+Rg-L组、PM+Rg-H组）症状均改善。

2.2 人参皂苷Rg1对PM2.5哮喘大鼠肺组织病理的影响

N组大鼠气管黏膜上皮结构完整，纤毛排列整齐，肺泡结构正常，无明显渗出，未见明显炎性细胞浸润（图1-a）。哮喘组支气管管腔变窄，管壁增厚，黏膜脱落，平滑肌增生，炎性细胞明显浸润，呈团块状聚集，肺泡扩张（图1-b）。经PM2.5损伤哮喘组管壁明显增厚，管腔变窄，肺泡塌陷，部分肺泡破裂融合，肺间质反应性增生明显，巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞明显增多（图1-c）。经人参皂苷Rg1干预后，大鼠管壁变薄，吞噬细胞、淋巴细胞数量减少（图1-d、e）。

2.3 PM2.5亚急性损伤哮喘大鼠肺电镜结果

N组肺组织電镜结构气管管腔完整，肺泡结构常，无明显渗出物，未见明显炎性细胞浸润（图2-a）。A组管腔变窄，管壁增厚，平滑肌增生，炎性细胞明显浸润，呈团块状聚集（图2-b）。经PM2.5损伤哮喘组可见大气颗粒物沉积于管腔和肺泡，部分肺泡破裂融合，肺间质反应性增生明显，巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞明显增多（图2-c）。经人参皂苷干预后，大鼠管壁变薄，吞噬细胞、淋巴细胞数量减少（图2-d、e）。

2.4 人参皂苷Rg1对PM2.5哮喘大鼠血清IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1的影响

与N组比较，经卵蛋白激发诱导后，A组血清IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1的表达量增大（P<0.01）;经PM2.5气管滴注后，PM+A组大鼠血清IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1进一步增加（P<0.01）;经人参皂苷Rg1干预后，可明显下调血清IL-17a、IL-6、IL-23、TGF-β1水平，PM+Rg-H组下降更为显著（P<0.01）。见表1。

2.5 人参皂苷Rg1对肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23的影响

与N组比较，经卵蛋白激发诱导后，A组肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23表达量增高（P<0.01）;经PM2.5气管滴注后，PM+A组大鼠肺泡灌洗液IL-17a、IL-6、IL-23水平进一步增加（P<0.01）;经人参皂苷Rg1干预后，可明显下调IL-17a、IL-6、IL-23水平，PM+Rg-H组下降更为明显（P<0.01）。见表2。

2.6 人参皂苷Rg1对肺组织RORγt mRNA表达的影响

RORγt是Th17细胞分化的关键因素，TGF-β、IL-6通过诱导RORγt表达，启动RORγt信号转导通路，进而促进Th17细胞的分化。A组大鼠经卵蛋白激发后，肺组织RORγt mRNA表达量增加（P<0.01）;经PM2.5气管滴注14 d后，RORγt mRNA表达量进一步上升，差异有统计学意义（P<0.01）。经人参皂苷Rg1干预后，RORγt mRNA表达量下调，PM+Rg-H组下降更为明显（P<0.01）。见表3。

3 讨论

我国PM2.5主要来源于燃煤、机动车尾气、土壤沙尘、建筑尘、冶炼尘等，其中机动车尾气已经超越燃煤成为城市PM2.5主要来源[11]。北京、上海、深圳机动车尾气PM2.5分别占到31.1%、29.2%和41%[12]。PM2.5颗粒直径小，会以更高的速率穿透呼吸道并沉积在肺泡中，其所包裹的毒性物质如有机物（OM）、硫酸盐（SO42-）、硝酸盐（NO3-）、铵盐（NH4+）和矿尘等，可致应激、炎症反应及过敏反应[13]。Meta分析我国1989—2014年文献显示PM2.5每增加10 μg/m3，呼吸系统疾病死亡率增加0.50%[14]。欧洲空气污染影响队列研究（ESCAPE）证实住宅附近PM2.5每增加5 μg/m3，儿童FEV1降低1.77%[15]。居住地距离主干道越近儿童，FVC降低越明显[16]。

Th17细胞是一种不同于Thl和Th2的CD4+调节性T细胞。TGF-β、IL-6作为诱导初始CD4+T细胞向Th17细胞分化的关键细胞因子，通过激活STAT3（Signal Transducer and Activator of Tranions 3）信号通路，活化Th17细胞分化关键核因子RORγt，促进Th17细胞分化和IL-17分泌[17-21]，进而诱导更多细胞释放炎症介质，促进气道内炎性细胞募集和激活，导致哮喘发病[22]。IL-17共6个亚型，其中IL-17a是重要的炎症介质，能引起组织坏死、器官衰竭，与哮喘气道炎症反应的急性加重正相关[23]。IL-23是由活化的树突状细胞、巨噬细胞及单核细胞等产生的炎症介质，促进活化的Th17细胞生长和增殖，缺乏IL-23的小鼠体内几乎检测不到Thl7细胞存在[24]，IL-23能保持Th17细胞稳定分泌IL-17a、IL-17f和IL-22等炎症介质[8，25]。

本研究显示卵白蛋白激发哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-23、TGF-β1、IL-6增加;经PM2.5气管滴注后哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液IL-17a、IL-23、TGF-β1、IL-6进一步增加;肺组织RORγt mRNA表达量上升。推测PM2.5及其有毒成分通过刺激TGF-β1、IL-6增高，来促进Th17细胞分化;同时通过激活STAT3-RORγt-IL-17/IL-23信号通路，上调RORγt mRNA和蛋白高表达，诱导Th0细胞向Th17分化，释放IL-17、IL-23炎症介质。IL-23具有稳定维持Th17细胞产生IL-17a等炎症介质作用，可持续增强致炎效应，促进气道重塑，肺组织支气管充血水肿，黏膜细胞脱落以及炎性细胞浸润等症状，最终导致哮喘发作或者加重。这与其他临床报道结果一致，哮喘患者BALF中IL-17、TGF-β明显增加，且在暴露于过敏原时，水平进一步迅速增加，提示IL-17、TGF-β是气道重塑和气道炎症反应的关键细胞因子，并与哮喘严重程度存在一定相关性[26-27]。

人参性平味甘微苦，有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津安神之功效，主要含有皂苷（Ginsenoside，GS）、多聚糖、多肽、聚炔醇和脂肪酸等活性成分。其中，皂苷Rgl为四环三萜类衍生物，具有抗氧化应激、抗炎症反应、抗纤维化和神经保护作用等功效[28-30]。有研究证明Rg1对内毒素导致肺血管内皮损伤的保护作用，对肺缺血再灌注损伤具有抗炎、抗细胞凋亡作用[10，31-32]，改善肺组织肺泡结构和肺间质炎性浸润，对脓毒症肺损伤有修复作用[33-34]。

本研究显示经皂苷Rg1干预后，可明显下调PM2.5哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液IL-6和TGF-β1含量，RORγt mRNA表达量下调，进而抑制IL-17a、IL-23的表达和释放，以上结果随着Rg1剂量上升而下降更为显著，并改善肺泡结构，减轻肺间质炎性浸润，说明皂苷Rg1呈剂量依赖性对于PM2.5致哮喘大鼠肺损伤，具有抑制气道炎症反应、改善肺损伤的作用。因此，人参皂苷Rg1有望用于PM2.5致气道损伤的有效药物。

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（2020-09-20收稿 责任编辑：徐颖）