大豆胞囊线虫侵染后GmC4H、GmLac55和GmLac85的表达模式分析

王 晗，金 贺，王旭东，张顺斌，夏诗宁，段玉玺，王 惠

（沈阳农业大学a.生物科学技术学院，b.植物保护学院，沈阳110161）

大豆（Glycinemax）原产于中国[1]，在中国已有五千年的栽培历史。因其种子富含丰富的植物蛋白质，是中国乃至全球重要的经济作物之一。大豆胞囊线虫（Heterodera glycines Ichinohe）通过大豆根部侵入大豆植株而影响大豆正常的生长发育过程，进而影响大豆产量。大豆胞囊线虫病是一种传播速度快、传播范围广、传染力强的土传性病害，由于大豆胞囊线虫分为多个生理小种，且休眠体存活时间长，同时寄主类型广泛，所以防治较为困难。目前大豆胞囊线虫病的防治方法主要为轮作、生物防治、化学防治以及培育抗性品种。

大豆胞囊线虫侵入大豆根系需要破坏根部细胞壁建立合胞体，木质素作为植物次生细胞壁结构材料，其沉积可加大细胞壁的厚度，进而成为大豆根系抵抗线虫攻击的第一道屏障[2]。研究结果表明，木质素及其代谢过程参与了大豆抗胞囊线虫的抗性响应[3]。木质素合成途径关键酶之一是肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)。在大豆中C4H只有一个拷贝[4]，将其命名为GmC4H。C4H在细胞中本来就存在，但C4H的表达会受到内外因素的共同诱导和调控作用，在遇到生物胁迫或者非生物胁迫时根据周围环境适时上调表达或者下调表达[5]。在盐碱条件下，实时定量PCR 结果表明，木质素生物合成相关基因的表达量上调，拟南芥根系细胞通过木质素沉积导致的细胞壁增厚来适应盐胁迫[5]。敲除棉花GhUMC1基因会导致木质素合成减少；过表达该基因会增强细胞壁的木质化，使棉花对黄萎病产生抗性[6-8]。漆酶（Laccase）是木质素合成途径的终端酶，在不同物种中会表现出不一样的催化特性和催化序列[9]。Lac基因在植物应对各种胁迫方面同样具有不可忽视的作用。在拟南芥漆酶基因家族中，AtLAC4、AtLAC11、AtLAC17对木质素的聚合有重要作用[10-11]。同时，在梨中通过转化证明了PbLAC1是参与木质素的生物合成与次生细胞壁的发育的[12]。目前研究学者已经从许多植物体内克隆并分离出了Lac基因，比如模式植物拟南芥[13]、棉花[14]、水稻[15]、柑橘[16]、梨[17]等。2019 年大豆基因组中鉴定出93 个Gm-Lac基因[18]。其中有的基因仅在某一特定器官内表达，如GmLac1和GmLac24在大豆根系内表达；有的基因在组织中表达水平相对较高，研究结果表明11 个GmLac在多个组织中高度表达[18]，本实验室通过前期筛选发现其中2个基因（GmLac55和GmLac85）在线虫侵染前后发生了差异表达。

本研究利用qPCR 技术及间苯三酚染色技术研究接种SCN3 后大豆植株木质素合成通路的GmC4H，Gm-Lac55和GmLac85基因在感病品种Williams82（W82）和抗病品种小粒黑豆（XLH）的根、茎、叶中的表达量变化，进而明确木质素合成通路关键酶基因对SCN的响应，为抗线品种的培育奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

感病大豆品种为Williams 82；抗病大豆品种为小粒黑豆（ZDD1412）。大豆胞囊线虫（SCN）3 号生理小种，由沈阳农业大学北方线虫所后山胞囊繁殖基地提供。

供试超纯RNA 提取试剂盒和试剂RNase free H2O 购自康为世纪生物科技有限公司；供试反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)、ddH2O、6×loading buffer、核酸染色剂（Golden View）、SYBR Green PCR master mix、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0购自TaKaRa大连宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 以Tubulinmotif（Glyma.15G132200）为内参基因，利用NCBI 在线设计GmC4H、Gm-Lac55和GmLac85的引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。实时荧光定量PCR 程序为：95 ℃预变性30s；95℃变性10s，60℃/30s，循环40 次；95℃变性15s，60℃/60s，95℃/15s，进行反应绘制熔解曲线。并根据2-ΔΔCT计算根茎叶中基因相对表达水平，其中试验组为接种SCN 的大豆植株，对照组为未接种SCN 的大豆植株。

表1 引物名称及序列Table 1 Primer name and Primer sequences

1.2.2 木质素染色 通过间苯三酚染色法[19]检测木质素在接种线虫前后的变化。接种线虫后第9 天，取形态相似的二级根系，用自来水清洗干净后，用刀片将根系切下，将根系样品迅速放入固定液[95%乙醇：冰醋酸（V/V）=1∶1]中浸泡24h。浸泡后用蒸馏水将根冲洗干净，再放入饱和氯醛水溶液（100g水合氯醛用50mLddH2O溶解）中并使用真空抽滤泵真空处理10min，将样品在室温下放置到透明。用1% 的间苯三酚溶液（5g 间苯三酚，25mL 95%乙醇，用ddH2O定容到500mL）将根系浸泡5min后滴加适量浓盐酸，然后在显微镜下观察拍照。

2 结果与分析

2.1 大豆胞囊线虫侵染后根中GmC4H、GmLac55和GmLac85的基因表达分析

由图1可知，在感病品种Williams82的根中，接种处理后GmC4H的表达量与对照相比差异不大。GmLac55表达量在接种后第1 天达到峰值，为对照的3.48 倍，第10 天为对照的2.76 倍，其余时间与对照相比无显著差异。在抗病品种小粒黑豆根中，接种处理后GmC4H的表达量在第5天达到峰值，为对照的2.24倍，其余时间与对照无显著差异。在抗病品种小粒黑豆根中，接种处理后GmLac55的表达量在第5天和第9天显著高于对照，分别是对照的3.27倍和3.39倍，其余时间与对照相比无显著差异。在感病品种Williams82的根中，接种处理后GmLac85的表达量在第9天达到峰值，为对照的2.12倍，其余时间与对照相比差异不显著。在抗病品种小粒黑豆根中，接种处理后GmLac85的表达量虽有上调趋势但与对照相比无显著差异。

图1 接种线虫后Williams 82和小粒黑豆根中GmC4H、GmLac55和GmLac85的相对表达量Figure 1 Relative expression levels of GmC4H,GmLac55 and GmLac85 in Williams82 and Xiaoliheidou roots

2.2 大豆胞囊线虫侵染后茎中GmC4H、GmLac55和GmLac85的基因表达分析

由图2可知，在感病品种Williams82的茎中，接种处理后GmC4H和GmLac85的相对表达水平均未达到显著水平。接种后大豆茎中GmLac55的表达量变化较显著，在接种后第7 天和第20 天的表达量是对照的2倍以上，差异分别达到显著和极显著水平。在抗病品种小粒黑豆的茎中，接种处理后GmC4H的表达量与对照相比差异不大。接种后大豆茎中GmLac55的表达量先升高后降低，在接种后第10 天表达量达到最高，为对照的11.63倍，接种后第15天开始与对照无显著差异。接种线虫后GmLac85的表达量先急剧升高后迅速下降，在第7天表达量达到峰值，为对照的32.48倍，接种后第15天开始与对照无显著差异。

图2 接种线虫后Williams 82和小粒黑豆茎中GmC4H,GmLac55和GmLac85的相对表达量Figure 2 Relative expression levels of GmC4H,GmLac55 and GmLac85 in Williams82 and Xiaoliheidou stems

2.3 大豆胞囊线虫侵染后叶中GmC4H、GmLac55和GmLac85的基因表达分析

由图3 可知，在感病品种Williams82 的叶中，接种处理后GmC4H和GmLac55的表达量与对照组相比差异不显著；GmLac85的表达量在接种后第1 天最高，为对照的1.81 倍，之后与对照相比无显著差异。在抗病品种小粒黑豆叶中，接种处理后GmC4H的表达量与对照相比无显著差异；GmLac85的表达量在接种后第1天升至最高，为对照的6.73 倍，其他时间与对照无显著差异；GmLac55的表达量在接种后的第1 天达到最高，为对照的7.61倍，其他时间与对照无显著差异。

图3 接种线虫后Williams 82和小粒黑豆叶中GmC4H、GmLac55和GmLac85的相对表达量Figure 3 Relative expression levels of GmC4H,GmLac55 and GmLac85 in Williams82 and Xiaoliheidou leaves

2.4 抗感品种大豆根部的木质素染色

由图4可知，在接种大豆胞囊线虫第9天，Williams82和小粒黑豆根系经间苯三酚染色后显微照片显示，木质部呈紫红色，与对照相比接种处理的根系木质部宽度明显增加。由表2 可知，除Williams82 接种处理第5 天外，接种线虫处理大豆根系中木质素含量均高于对照。随着接种线虫处理时间的延长，Williams82和小粒黑豆根系中的木质素含量大体呈逐渐增加的趋势。Williams82的根系中木质素含量在处理后第1天、第3天、第7天和第9天均高于小粒黑豆。

表2 木质素染色宽度Table 2 The depth of lignin staining

图4 大豆胞囊线虫侵染后根系的间苯三酚染色Figure 4 Phloroglucinol staining of soybean roots infected by SCN

3 讨论与结论

肉桂酸-4-羟基化酶和漆酶是木质素合成途径的关键酶和终端酶，对木质素的合成有重要作用。同时木质素是植物次生细胞壁的重要组成成分，在植物抵御逆境胁迫方面有重要作用[20]。杨慧芹等研究表明，在干旱和低温等非生物胁迫下，烟草中C4H的活性与木质素含量的变化趋势一致[21]；在烟草C4H表达受到干扰时，烟草中木质素的含量就会明显降低[22]。还有类似研究表明，根结线虫侵染水稻后，OsC4H 表达量上调时木质素含量也会增加，抗性增强[23]；当施用外源硫胺素和硅元素处理水稻后，OsC4H基因上调表达增加了木质素沉积、增强了抗性[24-25]。在对香蕉的漆酶基因家族的研究中发现，在低温处理时，部分漆酶基因表达量上调以此应对低温胁迫[26]。而大豆中在胞囊线虫胁迫下GmC4H和GmLac表达水平的具体变化尚未见详细报道。

抗性品种的培育是应对传播范围广、传染力强的土传性病害——大豆胞囊线虫病的一种最经济有效的方法。本研究以感病品种Williams 82 和抗病品种小粒黑豆为材料，在侵染大豆胞囊线虫后，利用实时荧光定量PCR 技术对GmC4H，GmLac55和GmLac85基因的表达量进行了分析，结果表明：在大豆胞囊线虫侵染大豆根部以后，GmC4H，GmLac55和GmLac85基因均被诱导表达。在抗病品种小粒黑豆根中，GmC4H基因的表达量在接种线虫后的第5天达到最高且显著高于其他时间点，是对照组的2.24倍，而在感病品种中表达量变化并不明显，甚至略低于对照组。同GmC4H相比，GmLac55和GmLac85在抗病品种和感病品种中的表达量变化都较为显著。GmLac55在感病品种接种线虫后第1天表达量最高，在抗病品种接种线虫后第5天显著上调并在第9天达到最高；而GmLac85在抗感两个品种中均在接种线虫后第9天达到最高。从整体来看，GmC4H、GmLac55和GmLac85在抗病品种中的表达量要高于感病品种，且在不同时期有上调表达和下调表达。结合线虫的侵入过程、生活史[27]及基因高表达的时间点，推测GmLac55可能在抵御线虫入侵大豆根部方面起作用，而GmC4H在接种线虫后第5天表达量上调最为显著，推测GmC4H在限制线虫在大豆根部细胞内的移动有不可忽视的作用，但是具体功能有待于下一步试验揭示。刘大伟[28]曾指出，线虫在侵染大豆植株后的第10 天会在体内形成合胞体以提供线虫发育所需要的营养物质，本研究中GmLac85在第9 天表达量明显上调，推测GmLac85基因在限制线虫在大豆根部内的发育有重要作用。

与此同时，在大豆胞囊线虫侵染抗感品种大豆根系后，在茎和叶中GmC4H、GmLac55和GmLac85在不同时间点也出现显著上调表达；且通过对比GmC4H、GmLac55和GmLac85在根、茎、叶中的表达量发现：三个基因在根、茎、叶中显著高表达的时间点是相同的或者相近的。可见，在大豆胞囊线虫侵染大豆根系后，在植株内发生信号传递，植株整体均产生胁迫响应，但是具体信号传递机制有待于后续试验揭示。

试验结果表明，大豆胞囊线虫侵染后GmC4H、GmLac55和GmLac85的表达量发生变化，木质素染色结果表明，大豆根系内的木质素含量也具有增加趋势，进一步说明了GmC4H、GmLac55和GmLac85基因表达水平的变化影响木质素含量，进而调节细胞壁厚度影响线虫侵染或定殖。