玫瑰花冠茶总黄酮提取的工艺优化

孙 瑶，朱雅婧，李 武，赵付安

（河南省农业科学院 经济作物研究所,河南 郑州 450002）

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）属蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa Linn.）落叶灌木，花色丰富，香味或浓厚，或淡雅，深受大家喜爱[1]。常见玫瑰是大马士革、保加利亚等品种，国际市场主流的玫瑰产品如精油等[2]，均以这些品种的提取物作为国际标准，因此国产玫瑰提取物难以进入国际高端化妆品市场。国内的玫瑰产业发展只能另辟蹊径[3-4]，发展“药食两用”玫瑰产品，玫瑰花茶就是其中之一。我国制造玫瑰花茶已有1 000 多年的历史。丰花玫瑰是我国自主培育的玫瑰品种，被国家轻工部规定为可食用玫瑰品种[5]。玫瑰花茶以半开放的玫瑰花品质最佳，成品茶香气浓郁、滋味甘美，广受人们喜爱[6]。采用新鲜玫瑰花制成的玫瑰花茶调理血气、养颜美容，长期饮用亦有助于促进新陈代谢，主要原因是其富含黄酮[7]。黄酮是2 个酚羟基的苯环通过中央三碳原子连结形成的一系列化合物的统称，是一种很强的抗氧剂，抗氧化作用可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症[8]的发生。不同分子结构的黄酮可作用于身体不同的器官，可有效清除体内的氧自由基，另外还具有消炎、镇痛等功效[9]。

黄酮普遍存在于各种植物中[10]，如洋葱[11]、大葱[12]、荔枝[13]、板栗壳[14]及各种中草药[15-17]等。不同植物中的黄酮成分有很大不同，因此不同植物的使用功效也不太一样。黄酮也是近年来研究的热点，玫瑰中富含黄酮，玫瑰及其相关制品受到人们青睐很大程度上也是因为黄酮的功效。目前，对黄酮提取的报道较多，有直接从植物食部提取黄酮的，也有从皮、壳[14，18]等废料中提取黄酮回收利用的。基于玫瑰花中黄酮的强大功效，试验从玫瑰花冠茶中提取了黄酮，并通过方法改良，优化得到了最佳提取工艺，为玫瑰黄酮的工业化生产奠定基础，对玫瑰花资源的开发利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

丰花玫瑰，采自河南现代农业研究开发基地，60 ℃下烘干成花冠茶，粉碎过60 目筛，保存备用；氢氧化钠、硝酸铝、硝酸钠、乙醇，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供；芦丁标准品，Solarbio，货号SR8250-100 mg。

1.2 仪器

Epoch 酶标仪，美国Bio-tek 公司产品；金属浴，金银杏生物科技（北京）有限公司产品；智能超声波清洗机，广东固特超声股份有限公司产品；Centrifuge 5424 型离心机，德国艾本德股份公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 玫瑰花冠茶的制备

在5 月盛花期，摘取花瓣已经打开不见花蕊的丰花玫瑰，早上7 点前摘取完毕。新鲜采摘的花冠置于空气能热泵中烘干，设置温度60 ℃。

1.3.2 玫瑰花冠茶总黄酮的提取

将烘干后的玫瑰花粉碎，过60 目筛。准确称取一定质量的干粉，加入适量体积分数乙醇，置于65 ℃温浴1 h，之后将粗提液置于离心机中以转速10 000 r/min 离心20 min，取上层清液备用。

1.3.3 黄酮提取工艺条件优化

采用单因素试验，考查花茶和乙醇的料液比（1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80，1∶100，1 ∶150，1 ∶200，1 ∶300）、乙醇体积分数（0，20%，40%，60%，70%，80%，90%，100%）、温浴温度（0，22，45，65，85 ℃）、提取时间（0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0，16 h）4 个条件进行优化，优化的结果通过测定黄酮产率分析条件优劣。

1.3.4 芦丁标准曲线绘制

准确称取适量芦丁标准品，加入一定体积乙醇充分溶解，配置质量浓度为20 mg/mL 的芦丁溶液。取一定体积的芦丁溶液，加蒸馏水稀释100 倍，最终配成0.2 mg/mL 的芦丁标准溶液，现用现配。准确芦丁0.2 mg/mL 标准溶液0，20，40，60，80，100 μL，分别置于干净的1.5 mL 棕色离心管中，补足70%乙醇至100 μL，加入5%亚硝酸钠25 μL，暗处静置6 min。静置后在体系中加入10%硝酸铝25 μL，混合均匀，继续暗处静置6 min。最后在离心管中加入5%氢氧化钠200 μL，70%乙醇150 μL，总体系500 μL，混匀后暗处静置15 min。使用96 孔板合理布板，每个离心管设置三重复点板，对照组设置为不加芦丁标准品，测定各组在510 nm 的吸光值，绘制标准曲线，对标准曲线进行线性拟合得到直线方程。

1.3.5 黄酮总含量的测定

黄酮含量测定参照王刚等人[18]的测定方法，进行一定改进。取适量黄酮提取液于1.5 mL 离心管中，按照1.3.4 中测定方法，测定不同条件下提取的黄酮于波长510 nm 处的吸光度。将吸光度代入对标准曲线拟合的线性方程，计算得到黄酮在500 μL 测定体系中的质量浓度，继而得到黄酮质量和在原提取液中的总质量。通过计算，最终得到提取的黄酮在花冠茶中所占的质量比，即产率。

式中：OD510——黄酮的510 nm 吸光值；

V总——加乙醇后原提取液的体积，mL；

k——芦丁标准曲线的斜率；

V取——从原提取液中取用的体积，mL；

m——称取花冠粉末的质量，mg。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 对数据进行处理分析，Origin 9.1 软件对数据进行作图。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

按照1.3.4 中试验方法，离心管中分别加入0.2 mg/mL 的芦丁标准溶液0，20，40，60，80，100 μL，则芦丁的质量浓度分别为0，8，16，24，32，40 μg/mL。以芦丁质量浓度为横坐标，OD510为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

标准曲线：吸光度=0.005 7×质量浓度，R2=0.998，其中斜率k=0.005 7。

2.2 料液比对黄酮产率的影响

分析料液比对提取黄酮产率的影响，乙醇和花茶的体积质量比（μL/μg）分别为10∶1，20∶1，40∶1，60∶1，80∶1，100∶1，150∶1，200∶1，300∶1，提取质量完成后，取上清液，亚硝酸钠-硝酸铝法测定黄酮浓度，计算质量分数。

黄酮产率随料液比的变化图见图2。

图2 黄酮产率随料液比的变化图

花茶和乙醇的体积质量比初始值为1∶10，随着料液比的增大，黄酮溶解量也在不断增大，其产率也随之增大；当料液比达到1∶100 时，现有方法能够提取出的黄酮溶解量达到最大，黄酮产率也达到最大；随着料液比继续增大，现有的提取方法和溶剂使得黄酮溶解量基本不变，产率浮动也趋于平缓，黄酮得率维持在稳定水平。当料液比达到1∶100后，溶剂用量增加但黄酮产率却不再变化，出于有效利用试剂和节省能耗的考虑，料液比选择1∶100更有利于丰花玫瑰中黄酮的提取。

2.3 乙醇体积分数对黄酮产率的影响

乙醇提取黄酮共设置8 个体积分数，分别为0，20%，40%，60%，70%，80%，90%，100%，在温浴超声离心后，测定不同乙醇体积分数下的黄酮产率。

乙醇体积分数对黄酮产率的影响见图3。

图3 乙醇体积分数对黄酮产率的影响

由图3 可知，溶剂中不加入乙醇即纯水溶液时，也有一定体积分数的黄酮析出；随着乙醇体积分数增大，黄酮析出量也增大，说明乙醇的加入有利于黄酮的溶解。当乙醇体积分数达到40%时，黄酮的溶解度最大，产率最高；继续增大乙醇的体积分数，黄酮的产率直线式下跌，说明乙醇体积分数超过40%，会影响黄酮的溶解，甚至不如纯水溶液中黄酮的产率；当使用100%乙醇时，黄酮产率跌至0.89%，是产率的最小值。乙醇体积分数的试验说明适量加入乙醇有利于黄酮的溶解，但乙醇体积分数超过40%则抑制了黄酮的析出和溶解，因此，乙醇体积分数为40%时能够有效提取丰花玫瑰中的黄酮。

2.4 温浴温度分析

控制提取条件料液比1∶100，乙醇体积分数40%，温浴1 h 条件下提取丰花玫瑰中的黄酮，温浴温度分别设定为0，22，45，65，85 ℃。

温浴温度对黄酮提取的影响见图4。

图4 温浴温度对黄酮提取的影响

由图4 可知，在温浴温度为45 ℃以下时，黄酮产率均在4.2%左右，温度对黄酮的溶解度影响不大；当温度超过45 ℃时，溶解度急剧增加，黄酮产率也随之增大；温浴温度为85 ℃时，产率与65 ℃时相比，既无增大也无减小的趋势，趋于平行。说明提取温度在45 ℃以下，温度不影响黄酮的溶解；温度高于45 ℃后，黄酮溶解度急剧增大，测得产率增大；温度增大到65 ℃时，产率达到峰值；继续提高温度，对黄酮的溶解度没有影响。综合分析，提取温度为65 ℃更有利于提高丰花玫瑰中的黄酮产率。

2.5 温浴时间分析

控制提取条件料液比1∶100，乙醇体积分数40%，温浴温度65 ℃条件下提取丰花玫瑰中的黄酮，温浴时间分别设定为0，30，60，90，120，150，180 min。

温浴时间对黄酮提取的影响见图5。

图5 温浴时间对黄酮提取的影响

由图5 可知，温浴时间延长，产率也随之增大；当温浴时间达到60 min 时，黄酮产率约为5.5%，达到最大；随着温浴时间继续延长，黄酮产率略有降低；温浴180 min 时，黄酮产率约为5.38%。综合分析，温浴时间为60 min 时，既能节省能源，也能最大效率地提取丰花玫瑰中的黄酮。

3 结论

黄酮广泛存在于高等植物的花、果、叶、茎及种子中。目前，常用的黄酮提取方式有超声波、微波辅助提取和有机溶剂浸润的方法等。超声提取工艺稳定、简单安全、成本低[19]，微波提取积小、节能、省时[20]，但无一例外，这2 种方法都需要配备超声仪或微波仪，对设备要求较高会大大提高成本。相比较来说，有机溶剂浸润的方式提取黄酮，同样可以做到成本低、耗时短、提取效率高，设备上仅要求水浴锅，完全可以实现生产应用。另外，这也是目前使用较为广泛[12，21-22]的提取方式，进一步说明了操作方法的简单易行。

丰花玫瑰是山东省平阴县玫瑰所培育的玫瑰品种，1998 年通过山东省审定，具有抗旱抗病、开花率高的特点。试验从丰花玫瑰中，采取有机溶剂浸润的方法提取花冠茶黄酮。在单因素控制条件下，主要考查影响黄酮提取的4 个因素：料液比、乙醇体积分数、温浴温度及时间。4 个因素中，相对来说，料液比和乙醇体积分数对黄酮提取的影响最大，控制好这2 个因素，可以使黄酮的提取效率提高约6 倍（从0.89%±0.20%提高到5.31%±0.04%）；同时，控制料液比和乙醇体积分数，可以更高效地利用乙醇的溶剂效应，使得黄酮更好溶出，这2 个因素也是节省成本的关键。控制温浴温度及时间可以有效提高黄酮的产出效率，产率可以从4.07%±0.35%提升到5.53%±0.26%。最终获得最佳制备工艺：花渣中加入40%乙醇，体积为花渣质量的100 倍，在65 ℃条件下，浸润1 h 可以获得丰花玫瑰最大黄酮提取效率5.50%±0.20%，为丰花玫瑰的食用价值提供理论依据。