三阴性乳腺癌组织MMP-9、PD-L1及OPN的表达情况及相关性分析

冯得财，钟惠婷，刘少杰，邹 伟，黄宇康△

广东省惠州市中心人民医院：1.乳腺外科；2.病理科，广东惠州 516000

三阴性乳腺癌是指乳腺癌病理组织检查结果显示雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)均为阴性的乳腺癌[1]。研究表明，三阴性乳腺癌患者发生肿瘤侵袭、远处转移的风险明显高于其他类型乳腺癌患者，预后较差[2]。因此，为提高三阴性乳腺癌患者治疗有效率、更准确地预测患者预后，近年来三阴性乳腺癌敏感的生物标志物已成为临床研究热点。程序性死亡配体-1(PD-L1)是一种在多种肿瘤细胞表面均可表达的负性共刺激蛋白，它是程序性死亡分子1(PD1)的配体，具有抑制T淋巴细胞活性的作用[3]。但目前对于其在三阴性乳腺癌中的临床研究仍较少。另外，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)也是一种与多种肿瘤发生侵袭、转移密切相关的分子，目前抑制MMP-9活性的药物研究得比较多[4]。骨桥蛋白(OPN)是一种在人体中广泛分布的糖蛋白，与肿瘤发展进程有关。由此推测OPN与MMP-9可能与三阴性乳腺癌发生、发展有关。本研究对三阴性乳腺癌患者乳腺肿瘤组织OPN、MMP-9、PD-L1表达情况进行检测，探讨三者之间的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年3月至2019年6月本院收治的74例三阴性乳腺癌患者作为研究组。纳入标准：(1)经病理组织学检查，符合原发性乳腺癌诊断标准[5]；(2)入组前未接受过任何放化疗及其他抗肿瘤治疗；(3)病理组织学检查ER、PR、HER-2阴性；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并其他部位肿瘤；(2)严重心、肝、肾功能障碍。另选择同期收治的41例单纯乳腺增生患者作为对照组。对照组患者年龄27～65岁，平均(51.25±4.38)岁；绝经情况：绝经28例，未绝经13例。研究组患者年龄29～63岁，平均(51.40±4.45)岁；绝经情况：绝经50例，未绝经24例。两组患者年龄、绝经情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获本院伦理委员会批准，所有患者及家属自愿签署知情同意书。

1.2方法 两组均通过病理组织学检查留取乳腺肿瘤组织标本或乳腺增生标本，常规石蜡包埋后切片。采用免疫组织化学染色法检测标本中OPN、MMP-9、PD-L1表达情况，步骤严格按照试剂盒说明书进行。一抗均购自博士德生物工程有限公司。采用双盲法，由两名不知道患者病理结果的病理医师进行评估。PD-L1阳性表达于细胞膜或细胞质，MMP-9与OPN阳性表达于细胞质。根据细胞着色程度及阳性细胞数积分之和进行评定：镜下观察到细胞膜或细胞质着棕黄色或黄褐色为阳性细胞。无任何着色积0分，着淡黄色积1分，着棕黄色积2分、着深棕黄色积3分。高倍镜下10个视野中阳性细胞数<5%积0分、5%～25%积1分、>25%～50%积2分、>50%积3分。积分之和≤1为阴性、>1为阳性。

1.3观察指标 (1)两组OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率；(2)研究组中不同病理特征患者OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率；(3)研究组患者OPN、MMP-9、PD-L1之间的相关性。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件分析数据，计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率比较 研究组OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率比较[n(%)]

2.2研究组中不同病理特征患者OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率比较 不同肿瘤最大径、TNM分期、病理组织分级患者的MMP-9和PD-L1阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同淋巴结转移情况患者的OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同肿瘤侵犯血管/神经情况患者的MMP-9阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同年龄、绝经情况、家族史患者的OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 研究组中不同病理特征患者OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率比较[n(%)]

续表2 研究组中不同病理特征患者OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率比较[n(%)]

2.3研究组患者OPN、MMP-9、PD-L1之间的相关性 相关性分析显示，OPN、MMP-9及PD-L1之间均呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 研究组患者OPN、MMP-9、PD-L1之间的相关性

3 讨 论

三阴性乳腺癌患者因缺乏ER、PR、HER-2，体内的激素受体及HER-2治疗的靶点也相应缺乏，患者对常规内分泌治疗药物不敏感，治疗后复发率也较高。肿瘤治疗的目的主要是提高免疫系统杀伤靶细胞的能力，从而抑制癌细胞无限增殖。免疫系统中免疫细胞的激活需抗原与共刺激分子共同作用[6]，三阴性乳腺癌患者免疫力低下，推测是由于能激活免疫细胞的共刺激分子的作用被抑制，导致T淋巴细胞无法正常活化、杀伤肿瘤细胞[7]。

近年来抗PD-L1药物已在多种肿瘤治疗中得到应用：付鹏等[8]报道，PD-L1/PD1抗体在治疗非小细胞肺癌时的有效性较化疗方案更有优势。林莉等[9]研究表示，PD-L1/PD1抗体在治疗B细胞淋巴瘤中具有较好疗效。PD-L1可与T淋巴细胞表面的PD1结合，产生一种负调节信号，直接抑制T淋巴细胞的活化，使机体免疫功能降低，肿瘤细胞发生免疫逃逸[10]。基于这一理论，本研究检测了三阴性乳腺癌组织中PD-L1的表达情况，探讨PD-L1在三阴性乳腺癌发生、发展中的作用。MMP-9属于基质金属蛋白酶(MMP)家族，能水解细胞外基质，促进肿瘤细胞发生侵袭、转移，MMP-9抑制药物已在多种肿瘤的治疗中被证实有较好的应用价值[11]。当乳腺癌继续进展，肿瘤组织会逐渐向远处器官转移，如常见的骨转移[12]。OPN作为一种骨基质糖蛋白，其可促进破骨细胞对骨质的吸收，进而造成异常骨基质吸收，在乳腺肿瘤细胞发生远处转移过程中起潜在的促进作用[13]。OPN在早晚期肿瘤、肉芽肿炎症等病变组织中均可发挥重要作用。从OPN结构分析，其具有3个MMP酶切位点[14]，这意味着MMP可能与OPN之间存在某种相互作用机制。冯婉雯等[15]研究发现，OPN、MMP-9表达水平与宫颈癌预后密切相关。

本研究对单纯乳腺增生及三阴性乳腺癌患者病理组织标本中PD-L1、MMP-9、OPN阳性表达率的检测结果显示，研究组患者OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率明显较高，这一结果与OPN、MMP-9、PD-L1与多种肿瘤发生、发展有关的理论相符。本研究继续对不同临床病理特征三阴性乳腺癌患者的OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率进行分析后，发现不同年龄、绝经情况及家族史患者的OPN、MMP-9、PD-L1阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。MMP-9在肿瘤最大径>20 mm、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、病理组织分级Ⅱ～Ⅲ级、发生淋巴结转移、肿瘤侵犯血管/神经患者中的阳性表达率均明显高于同组其他患者(P<0.05)。这表示MMP-9不仅在多数三阴性乳腺癌患者中高表达，并且其高表达情况与患者本身肿瘤进展程度有关。肿瘤最大径>20 mm表示患者肿瘤增殖快，TNM分期Ⅱ～Ⅲ期及病理组织分级Ⅱ～Ⅲ级表示患者肿瘤已逐渐发展至中晚期，发生淋巴结转移或肿瘤侵犯血管/神经表示患者肿瘤发生远处器官转移的风险越高。以上结果表明MMP-9与三阴性乳腺癌患者肿瘤细胞增殖、转移、侵袭密切相关。PD-L1在肿瘤最大径>20 mm、TNM分期Ⅲ期、病理组织分级Ⅲ级、发生淋巴结转移患者中的阳性表达率均明显高于同组其他患者(P<0.05)。其在不同病理特征患者中的高表达情况与MMP-9类似，推测二者可能具有相互促进作用。本研究中OPN仅在发生淋巴结转移的患者中阳性表达率较高。分析原因：可能是由于本研究中OPN表达情况受样本量限制，导致其在不同病理特征患者之间无法体现出统计学意义。本研究中相关性分析发现，PD-L1表达水平与MMP-9、OPN呈正相关，OPN表达水平与MMP-9也呈正相关，表明三阴性乳腺癌患者PD-L1表达水平升高能使MMP-9及OPN也升高。但三者之间作用机制尚不完全明确。

综上所述，OPN、MMP-9、PD-L1在三阴性乳腺癌组织中高表达，且其阳性表达率可能与肿瘤最大径、发生淋巴结转移及侵袭状态等有关。通过检测3种分子的表达情况，可对三阴性乳腺癌患者发生远处转移、侵袭的风险进行评估，从而为患者后续治疗提供参考。