中药复合小肽对于肉鸡小肠形态、盲肠肠道菌群和生产性能的影响

崔宇擎，卢春雨，刘依山，靳国忠，郭艺伟，史万玉,2*，包永占,2*，张晓东

( 1.河北农业大学 中兽医学院,河北 保定 071000;2.河北省中兽药工程技术研究中心,河北 保定 071000；3.河北肽丰生物科技有限公司，河北 邯郸 056000)

过去10年里，人们对功能性食品的兴趣不断增长，详细介绍食品衍生的生物活性肽有益作用的知识也越来越多[1]。从植物和动物蛋白中都发现了生物活性肽，据研究表明，生物活性肽具有广泛的药理活性作用，如抗菌活性、促进矿物质吸收、降血压降血脂、免疫调节作用以及肠道调节作用等[2]。已有研究报道，摄入大豆肽比摄入蛋白质或氨基酸混合物更容易被机体吸收，并能促进鸡嗉囊、空肠、盲肠与直肠内乳酸菌的增殖，抑制大肠杆菌和需氧菌增殖[3]。另有研究发现，饲料中添加适度比例黄芪，可通过影响乳酸菌和大肠杆菌的丰度，提高断乳仔猪生长性能[4]。刘卫东等[5]试验表明，在肉鸡日粮中适当添加复合小肽制剂，有利于雏鸡免疫器官的发育，降低死亡率和发病率。李巨民等[6]试验表明，在日粮中添加中药复合小肽能提高饲料消化利用率，防治高血脂症和炎症的发生。

肠道微生物群是其宿主不可分割的组成部分。微生物群在宿主的健康上起着关键作用，包括肠上皮细胞的增殖、对病原体的防御、次生代谢产物的产生和复杂碳水化合物的消化。这个微生态系统可以执行许多代谢功能，这些功能会随着肠道内微生物组成的变化而变化[7]。肠道微生物是人类和动物健康的重要指标。本研究探讨了在肉鸡饲料中添加不同剂量中药复合小肽对肉鸡肠道发育的影响。通过高通量测序分析探究中药复合小肽对肉鸡肠道菌群的影响，进而促进中药复合小肽在肉鸡健康养殖中的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料中药复合小肽成分为大豆肽64.8%、小麦胚芽粉25.0%、黄芪酶解物10.0%、维生素C 0.2%，由河北肽丰生物科技有限公司提供；酶制剂为50 000 U/g木聚糖酶，由河北肽丰生物科技有限公司提供；微生态制剂为枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌，由河北肽丰生物科技有限公司提供。

1.2 试验动物及分组选用1日龄健康AA肉仔鸡60只，由河北大午有限公司提供。随机分为6组，每组10只。MC组为空白对照组，饲喂基础日粮；MD、MZ、MG组，分别在基础日粮中添加低(250 g/t)、中(500 g/t)、高(750 g/t)剂量的中药复合小肽；MS组为微生态制剂组(100 g/t微生态制剂)；MM组为酶制剂组(100 g/t酶制剂)。试验期为42 d。

1.3 样品采集肉鸡42日龄时，处死后剖检，取十二指肠、空肠和回肠，生理盐水冲洗后固定于10%福尔马林溶液中。收集盲肠内容物，置于冻存管内，立即放置于液氮中，用于肠道微生物16S rRNA测序。

1.4 测定指标

1.4.1肠绒毛形态观察及测量 各组肉鸡解剖后分离肠道，取十二指肠中段、空肠中段和回肠中段各1 cm，用生理盐水冲洗干净，放置于10%福尔马林溶液中固定，按常规方法制备石蜡切片，经H&E染色后，光镜下观察石蜡切片。使用Image J软件对肠绒毛高度和隐窝深度进行测定。

1.4.2肠道微生物多样性检测 使用DNeasy PowerSoil试剂盒(QIAGEN,Inc.,Netherlands)提取盲肠内容物中总微生物基因组DNA样本，用正向引物515F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物907R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌16S rRNA基因V3～V4区进行PCR扩增。使用Illlumina MiSeq平台和MiSeq试剂Kit v3进行测序。获得的序列通过 Mothur软件平台，剔除低质量DNA序列后,计算序列之间的距离。每一个运算分类单元OTU代表序列相似度大于97%的DNA序列，对各试验处理组测序结果进行菌群多样性分析和聚类分析。

2 结果

2.1 小肠组织形态学观察

2.1.1十二指肠组织形态学观察 结果见图1，十二指肠绒毛为宽的叶片状，与MC、MS和MM组相比，MZ、MG组十二指肠的绒毛长度明显变长。

A.MC组；B.MS组；C.MM组；D.MD组；E.MZ组； F.MG组

2.1.2空肠组织形态学观察 结果见图2，空肠绒毛以指状为主，与MC、MS和MM组相比，MZ、MG组空肠绒毛长度明显增加。

2.1.3回肠组织形态学观察 结果见图3，回肠绒毛为短锥状，排列疏松，与MC、MS和MM组相比，试验组眼观均无明显变化。

A.MC组；B.MS组；C.MM组；D.MD组；E.MZ组； F.MG组。

2.2 各组肉鸡小肠绒毛长度和绒毛与隐窝深度的比值(V/C)

2.2.1各组肉鸡小肠绒毛长度 结果见图4， MD组的十二指肠绒毛长度显著高于MS和MM组(P<0.05)；MZ组的十二指肠绒毛长度显著高于MM组(P<0.05)，空肠绒毛长度显著高于MC组(P<0.05)；MG组的十二指肠绒毛长度显著高于MC、MS和MM组(P<0.05)。各组回肠绒毛长度无显著性差异。

注：相同小写字母表示无显著性差异(P>0.05),不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)，下同

2.2.2各组肉鸡绒毛与隐窝深度的比值(V/C) 结果见图5，MZ、MG组的十二指肠V/R显著高于MC、MS和MM组(P<0.05)，MZ和MG组的空肠V/C显著高于MC和MS组(P<0.05)，各组回肠V/C无显著性差异。

图5 中药复合小肽对于肉鸡绒毛与隐窝深度比值的影响

2.3 盲肠菌群OTU分析结果见图6，MG组的属水平OTU显著高于MC组(P<0.05)，其他组属水平OTU无显著性差异。

图6 属水平OTU分析

2.4 盲肠菌群Alpha多样性分析如图7所示，物种积累曲线随着测试样本的增加逐渐变得平缓，说明样本量已经足以反应群落的丰富度。丰度等级曲线的平缓程度反应群落的均匀度，盲肠肠道菌群的丰度等级曲线比较平缓，说明群落的均匀度比较高。

A.物种积累曲线；B.丰度等级曲线

2.5 盲肠菌群结构分析结果见图8，门水平上，有2个菌门占比90%以上，分别是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。其中最多的是拟杆菌门(Bacteroidetes)，其次是厚壁菌门(Firmicutes)。MD组的盲肠拟杆菌门(Bacteroidetes)含量显著高于MC和MS组(P<0.05)。属水平上，MD组的盲肠粪杆菌属(Faecalibacterium)含量显著低于MC组(P<0.05);MD、MZ、MG、MS和MM组的盲肠乳酸杆菌属(Lactobacillus)含量高于MC组(P>0.05)。

A.门水平分类学组成分析;B.属水平分类学组成分析;横坐标为该分组方案各样本/各分组/整体的名称；纵坐标为特定分类水平下各分类单元的相对丰度

2.6 盲肠菌群Lefse(LDA effect size)分析在MG组中具有丰度差异的微生物类群是β-变形菌门(Betaproteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)、伯克霍尔德菌目(Burkholderiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)和黄杆菌科(Flavobacteriaceae)。在MM组中具有丰度差异的微生物类群是艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)，结果见图9A。

MG组中具有丰度差异的微生物类群是β-变形菌门(Betaproteobacteria)和黄杆菌纲(Flavobacteriia)。β-变形菌门(Betaproteobacteria)向外映射到伯克霍尔德菌目(Burkholderiales)； 黄杆菌纲(Flavobacteriia)向外映射到黄杆菌目(Flavobacteriales)，最后到黄杆菌科(Flavobacteriaceae)，结果见图9B。

A.基于LDA值的分布直方图；B.分类学分支图;LDA临界值为2

2.7 中药复合小肽对于肉鸡生产性能的影响

2.7.1中药复合小肽对于肉鸡体质量的影响 21日龄各组体质量无显著性差异。42日龄MD组的体质量显著高于MC和MS组(P<0.05)；MZ和MG组的体质量显著高于MC、MM和MS组(P<0.05)(图10)。

图10 中药复合小肽对21和42 d肉鸡体质量的影响

2.7.2中药复合小肽对于肉鸡料肉比的影响 0～21日龄,肉鸡料肉比随着CSPCM的添加剂量的上升而减少，添加酶制剂和微生态制剂也可以降低料肉比。22～42日龄肉鸡料肉比随着CSPCM的添加而大幅减少，添加酶制剂和微生态制剂也可以降低料肉比(表1)。

表1 中药复合小肽对肉鸡料肉比的影响

3 讨论

小肠是化学性消化吸收的主要器官，是蛋白质、氨基酸、淀粉、麦芽糖和葡萄糖的主要吸收部位，小肠消化功能的增强将有助于营养物质的充分吸收[8]。小肠作为营养物质吸收的重要位置，小肠绒毛高度增加可以提高小肠与肠道内容物的接触面积，从而增加营养物质的沉积，对于提高肉鸡的生产性能具有重要意义[9]。隐窝深度反映了隐窝细胞的増殖率和成熟度，隐窝变浅则分泌功能增强，绒毛上皮细胞再生能力强，更有利于维持肠道的吸收功能[10]。绒毛高度越高，与营养物质的接触就越充分，营养物质沉积的效率就越高[11]。本试验结果表明，与MC组相比，添加CSPCM的MZ、MG组能够提高十二指肠和空肠的绒毛长度和V/C值，而MM组和MS组的绒毛长度和V/C值都无显著性提高。可以初步判断，中、高剂量的CSPCM能够促进营养物质的转运和吸收，增强肠道功能，提高肉鸡生产性能。

研究表明，肉鸡肠道菌群门水平上丰度较高的菌群是拟杆菌门和厚壁菌门(>90%)，其他研究对鸡盲肠菌群的研究结果类似[12-14]。本试验中门水平丰度最高的是拟杆菌门。已有研究表明，属水平上，瘤胃球菌、乳杆菌、梭状芽孢杆菌和拟杆菌属在鸡肠道中丰度在70%以上[12,15]，是主要菌属。在本试验中丰度最高的是另枝菌属(Alistipes),然后是粪杆菌属(Faecalibacterium),其次是乳酸杆菌属(Lactobacillus)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)，与前人研究结果不同。在试验中出现这些差异的原因可能主要与饲料成分有关。已有研究表明，在饲料中添加中药、酶制剂和微生态制剂都能够增加肠道内乳酸菌等有益菌的占比[16-18]，本研究对中药复合小肽、酶制剂和微生态制剂改善肠道菌群的效果进行了对比。发现在饲料中添加中药复合小肽、酶制剂和微生态制剂能够提高肠道内乳酸杆菌的含量，与饲料转化率值较高的肉鸡品系相比，饲料转化率值较低的鸡在粪便样品中显示出了较高的乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度[19]，说明在饲料中添加CSPCM、微生态制剂和酶制剂均能不同程度促进肉鸡的消化吸收。

Lefse(LDA effect size)用于分析各组在统计学上有差异的生物标志物，来分析组间有显著性差异的物种。本试验结果显示在MG组具有丰度差异的物种是伯克霍尔德菌目(Burkholderiales)和黄杆菌科(Flavobacteriaceae)。伯克霍尔德菌(Burkholderiales)能产生多种具有抗菌活性的代谢产物如铁载体(pyochenlin、pyoverdine)和单萜生物碱等[20]，而黄杆菌科(Flavobacteriaceae)可发酵葡萄糖、果糖和麦芽糖，能够帮助宿主消化吸收，从而促进生长[21]。

肉鸡作为一种经济动物，饲料添加剂对于生产性能的改善是尤为重要的。随着在饲料中CSPCM添加剂量的上升，对于肉鸡体质量和料肉比的改善越发明显，结合小肠绒毛长度与隐窝深度的比值发现其趋势一致，说明CSPCM的添加可能是通过增加绒毛长度和降低隐窝深度进行作用的。CSPCM对于肉鸡生产性能的改善也让其更具有了实际应用的意义。在饲料中添加中、高剂量的CSPCM可以通过增加十二指肠和空肠的绒毛长度、V/C值、盲肠内有益菌含量和降低料肉比来促进肉鸡生长。低剂量的CSPCM可以通过增加盲肠内拟杆菌门菌群丰度来促进营养物质消化吸收。

综上所述，在饲料中添加CSPCM能够改善盲肠菌群。在饲料中添加高剂量CSPCM有利于肉鸡小肠发育从而达到促进肉鸡生长的效果是最好的，并且其促生长效果优于微生态制剂和酶制剂。