血根碱对无乳链球菌抗菌活性及作用机制

宋 军，吕观新，王晗晟，刘 梦，王建发，孙东波，武 瑞

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江省牛病防制重点实验室，黑龙江 大庆 163319)

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是引起传染性奶牛乳腺炎主要致病菌之一[1]。近年来关于无乳链球菌引起奶牛乳腺炎的报道逐年增多，在某些地区无乳链球菌的检出率高达70%[2]，造成了巨大的经济损失[3]，严重影响了奶牛养殖业和乳品行业。同时，无乳链球菌也是重要的人畜共患性致病菌，可以感染人类和其他动物，具有重要的公共卫生意义[4-5]。由于临床抗菌药物不合理的使用，导致无乳链球菌致病性、耐药性逐渐增强，严重威胁畜牧业发展和人类健康[6-7]。因此，有效防控无乳链球菌对于奶牛养殖业的发展非常重要。

与传统的抗生素相比，中草药来源广泛、活性高、安全性好，是一种绿色、新型、高效的抗生素替代品之一，现已成为研究的热点，具有广泛的应用前景。血根碱(C20H15O5N)是一种苯菲喹啉类生物碱，是博落回提取物的重要有效成分，具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤[8]、抗菌[9]、抗炎[10]、抗肿瘤[11]以及抗血管生成[12]等。

前期研究表明，血根碱对鱼源无乳链球菌具有较好的抑菌效果，在抑制细菌生长的同时还能够抑制无乳链球菌形成生物被膜结构的形成[13]。为此，本研究主要评价血根碱对牛源无乳链球菌的抗菌活性，探究血根碱对无乳链球菌的抗菌机制，为临床无乳链球菌性奶牛乳腺炎的防治提供了新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 菌株及药品来源无乳链球菌ATCC13813购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；牛源无乳链球菌分离株由黑龙江省牛病防制重点实验室保存；血根碱(99%)购自中国食品药品检定研究院。

1.2 主要试剂和仪器脑心浸出液肉汤(BHI)购自青岛海博生物技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；电热恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)；低温冷离心机(德国艾本德股份公司)；酶标仪Elx800(美国BioTek公司)；流式细胞仪CytoFLEX(美国贝克曼库尔特)；Hitachi S-4800扫描电子显微镜(日本日立公司)；JEM-2100 Plus透射电子显微镜(日本电子株式会社)。

1.3 血根碱对无乳链球菌抗菌活性

1.3.1最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC) 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的测定参考WIEGAND等[14]的方法略作修改。血根碱以2%DMSO为溶剂，配置成5 g/L备用。用BHI培养基对血根碱进行倍比稀释，每孔100 μL加至96孔微量培养板中，同时每孔加入100 μL浓度约为105CFU/mL对数生长期无乳链球菌菌液，置于37℃培养箱中培养24 h，每组3个重复。设立DMSO对照组、空白对照(BHI培养基)和阴性(PBS)对照组。以没有肉眼可见的细菌生长的最小质量浓度为血根碱的MIC。最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)是指将MIC以上各孔培养物，分别吸取100 μL接种在BHI琼脂培养基上，37℃恒温培养24 h，进行菌落计数，其菌落数少于5个的血根碱浓度。

1.3.2血根碱对无乳链球菌生长的影响 采用DIAO等[15]的方法，稍作修改。将无乳链球菌培养至对数生长期，按1%接种不同浓度血根碱(0.25×MIC、0.50×MIC、1.00×MIC与2.00×MIC)至无菌BHI培养基中，置于37℃，160 r/min 摇床培养8 h，每间隔30 min取样测600 nm处吸光度，绘制时间—抑菌曲线。以不添加血根碱的菌液作为对照组，每组做3次重复。

1.4 溶血活性参考PENG等[16]的方法做适当修改。新鲜采集兔血在4℃下1 000×g离心5 min，得到rRBCs用阿氏液洗涤3次，稀释10倍(pH 7.4)。然后，50 μL rRBC解决方案(最终浓度为5%)加入等量不同浓度的血根碱。在37℃孵育60 min后测定上清液在450 nm处的吸光度。rRBCs分别用0.1% Triton X-100和阿氏液处理后,设置为阴性对照和阳性对照。每个测试是一式3份，测试2次。溶血程度按下式计算：溶血率=[(样品D450-阴性D450)/(阳性D450-阴性D450)]×100%。

1.5 血根碱对无乳链球菌细胞膜的影响

1.5.1血根碱对无乳链球菌D260和D280的影响 参考CHEN等[17]的方法测定血根碱对无乳链球菌紫外吸收物质的影响。将血根碱加入待测菌株培养液中，使终浓度为1.00×MIC。置于37℃，150 r/min 摇床中振荡培养，8 h内每间隔1 h取样4 000 r/min、4℃离心10 min，通过紫外分光光度计测定菌体上清液的D260和D280值，每组做重复3次，数据取平均值。

1.5.2血根碱对无乳链球菌存活率的影响 参考吴学友等[18]的方法，适当调整试验步骤。将对数期无乳链球菌(D600=0.5)用PBS(0.01 mol/L、pH 7.4)清洗和重悬。菌悬液(终浓度为108CFU/mL)与血根碱(终浓度1.00×MIC)等体积混合。在37℃条件下培养1 h后用PBS清洗、重悬。加入荧光染料碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，使其终质量浓度均为5 mg/L，37℃条件下避光孵育10 min，用PBS清洗、重悬后，采用流式细胞仪对染色细胞进行计数分析。

1.5.3胞外乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定 将无乳链球菌活化培养至对数生长期，并接种至含终浓度1.00×MIC的血根碱液体培养基中，使含菌浓度为108CFU/mL，同时用PBS代替血根碱药液作为对照组，37℃ 160 r/min 摇床培养。8 h内每间隔1 h，各取1.0 mL，用0.22 μm孔径的无菌滤器过滤，取滤液，按乳酸脱氢酶检测试盒说明书测定LDH含量。

1.6 血根碱对无乳链球菌细胞形态的影响将培养至对数生长期的无乳链球菌用PBS(0.01 mol/L、pH 7.4)制备为108CFU/mL的菌悬液，加入血根碱(终浓度1.00×MIC)。37℃作用6 h后，4 000 r/min离心10 min，用PBS清洗3遍，菌体用2.5%戊二醛4℃条件下固定过夜。随后，用乙醇(30%，50%，70%，85%，90%和100%)对样品进行连续梯度脱水，用叔丁醇代替乙醇脱水2次，干燥仪干燥样品，喷金制样，采用日立S-4800扫描电子显微镜观察。

1.7 血根碱对无乳链球菌细胞超微结构的影响前期菌体固定与扫描电镜样品制备方法一致，2.5%戊二醛固定后用PBS清洗菌体3遍，1%锇酸溶液固定1 h，用PBS清洗菌体3遍，丙酮梯度脱水。环氧树脂包埋过夜，50℃烘干48 h。1%乙酸双氧铀染色，切片制样后采用JEM-2100 Plus透射电子显微镜观察。

2 结果

2.1 MIC和MBC通过测定血根碱对无乳链球菌ATCC13813及牛源分离株的抗菌活性，表明血根碱对无乳链球菌MIC为9 mg/L，MBC为36 mg/L。

2.2 血根碱对无乳链球菌的抑菌动力学曲线D600是追踪液体培养物中微生物生长的方法之一，可以考察血根碱对乳源病原菌无乳链球菌生长的抑制作用。向对数生长期菌液中加入不同浓度血根碱后，试验组D600呈不同程度的抑制。加入血根碱(1.00×MIC和2.00×MIC)，8 h内无乳链球菌完全被抑制，菌液澄清停止生长；血根碱在亚抑菌浓度(0.50×MIC)下细菌生长缓慢，但随着作用时间延长，细菌生长速率超过被抑制速率，5 h左右开始逐渐增长。这表明适当浓度的血根碱能明显抑制无乳链球菌的生长。

2.3 溶血活性为了进一步了解血根碱对哺乳动物细胞膜的毒性，检测了不同浓度血根碱对兔血红细胞的溶血活性。从图2A中可以看出，低浓度血根碱对兔红细胞没有裂解活性。当血根碱浓度达到4.00×MIC时，对红细胞表现出了溶血活性(41.3%)。但从图2B中能够看出，血根碱浓度为4.00×MIC时，血根碱本身的颜色影响了450 nm吸光度的测定，导致溶血活性的增高。

A.450 nm吸光度测定；B.定性检测溶血活性

2.4 血根碱对无乳链球菌D260和D280的影响如图3A所示，随着作用时间延长，血根碱处理组和对照组D260都增高，但血根碱处理组D260显著高于对照组，说明核酸类物质释放到细胞外环境中。血根碱处理组D280随着时间延长不断延长，前3 h增长较快，后趋于平稳，同样显著高于对照组(图3B)，说明蛋白质类物质释放到细胞外环境中。细胞外上清液中D260和D280的增加表明血根碱(1.00×MIC)能破坏细胞膜，使无乳链球菌细胞中的大分子物质外流，进而影响细胞生长代谢。

图3 血根碱对无乳链球菌D260(A)和D280(B)的影响

2.5 血根碱对无乳链球菌存活率的影响从图4A所示，没被血根碱处理的对照细胞所处的区域为无PI荧光活性信号的区域，血根碱处理后的大部分细胞被荧光标记，细胞所处的区域发生改变。血根碱(1.00×MIC)处理后，有74.12%的细胞被PI染成阳性细胞，呈红色荧光(图4B)。因此，流式细胞仪分析结果说明血根碱能够破坏细胞膜，诱导PI流入细胞内。

图4 流式细胞术检测细胞膜损伤情况

2.6 胞外LDH活性的测定在细胞遭受损伤通透性改变的情况下，LDH会泄漏至胞外，通过检测菌液中LDH活力的变化，也可反映细菌细胞膜的损伤情况[19]。在培养期间，对照组胞外LDH活性变化不显著，血根碱(1.00×MIC)处理组胞外LDH活性随着时间延长而增加(图5)。推测血根碱处理的无乳链球菌膜通透性变大，存在于细胞浆内的LDH和核酸等生物大分子外流，细胞营养物质丢失，从而抑菌杀菌。这说明血根碱不仅能提高无乳链球菌细胞膜通透性，而且能破坏细胞膜的完整性。

图5 血根碱对无乳链球菌菌液LDH活力的影响

2.7 血根碱对无乳链球菌细胞形态和超微结构的影响通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜直接的观察无乳链球菌的外部形态和内部结构的变化[16,20-21]。由SEM观察结果(图6)显示，未加血根碱空白对照组(图6A)无乳链球菌细胞呈典型的链状、形态饱满圆润、表面光滑。血根碱(9 mg/L)处理组(图6B，C)大部分细胞呈黏连状态，细胞表面塌陷、皱缩，甚至破裂。由TEM观察结果(图7)显示，未经血根碱处理的无乳链球菌细菌细胞壁和细胞膜完整，内容物致密，均匀分布，细胞形态完整。血根碱(9 mg/L)处理的细胞，菌体结构疏松、变形，电子密度降低、胞内透亮，细胞壁破裂、内容物泄漏(图7B，C)。这说明血根碱对无乳链球菌的内部结构及外部形态均造成了破坏性影响。

A.空白对照组；B，C.9 mg/L血根碱；1.细菌细胞皱缩、链断裂；2.细菌细胞皱缩；3.细菌细胞破裂，内容物释放

A.空白对照组；B，C.9 mg/L血根碱；1.细菌细胞皱缩；2.细菌细胞内容物减少，质壁分离；3.细菌细胞破裂，内容物释放

3 讨论

本试验测得血根碱对无乳链球菌MIC为9 mg/L，MBC为36 mg/L，与丁浩等[13]的试验结果不完全一致，可能是因为无乳链球菌来源不同，细菌对药物的耐受能力存在差异。为了评估药物的安全性测定了血根碱对哺乳动物红细胞的毒性，当血根碱浓度达到4.00×MIC时，表现对红细胞的溶血活性，这主要是血根碱本身的颜色会使450 nm吸光度增高，造成对红细胞溶血活性增加的现象。从图2中不难看出，当血根碱为MBC时对无乳链球菌的抗菌作用是安全有效的。

目前，虽然已有文献报道血根碱具有抗菌作用，但对其抗菌机制的研究较少[22]。抗菌药物抑制细菌生长的机制较为复杂，包括抑制细胞壁的合成、直接破坏细胞膜、抑制核酸和蛋白质的合成和抑制核酸代谢等[23]。图1结果显示，当血根碱浓度为0.50×MIC时，5 h内能够明显抑制无乳链球菌生长，之后随着时间的推移无乳链球菌缓慢增长。说明血根碱可能诱导膜结合细胞壁自溶酶的释放[24]，或者弱化了细胞壁对维持细胞形态的作用[25]，导致部分菌体细胞裂解。

图1 不同浓度血根碱对无乳链球菌生长的影响

细胞膜作为细菌自我保护的第一道屏障，在防御系统中发挥着重要作用[26]，许多药物、抗菌肽都是通过诱导细菌细胞膜渗透性的变化来展开抗菌活性的[27]。因此，本试验通过测定血根碱作用无乳链球菌后细菌上清液D260和D280来评价细菌细胞膜的完整性并探讨其抑菌作用机制[28-29]。结果显示，与对照组相比试验组D260和D280显著升高，血根碱(1.00×MIC)能使细菌细胞内的核酸和蛋白质等大分子物质外流，进而影响细胞代谢。荧光染料PI流入胞内能够说明药物对细菌细胞膜完整性的影响[30]。流式细胞仪检测结果表明有74.12%的细胞被PI染成阳性细胞，说明血根碱破坏了无乳链球菌细胞膜完整性。进一步检测胞外乳酸脱氢酶的活性，血根碱处理后胞外LDH活性随着时间延长而增加，表明血根碱不仅能提高无乳链球菌细胞膜通透性，而且能破坏细胞膜的完整性，与胞外紫外吸收变化和流式细胞仪检测结果相对应。结合扫描电镜和透射电镜观察，血根碱处理后，细菌细胞呈黏连状态，细胞表面塌陷、内部电子密度降低、胞内透亮，细胞壁破裂、内容物外流，说明血根碱对无乳链球菌的内部结构及外部形态均造成破坏性影响，与上述结果相吻合。

上述结果全方位证明了血根碱对无乳链球菌细胞的损伤。血根碱的抑菌机制可能与其理化特性相关，与无乳链球菌表面某些物质作用后引起细胞膜结构改变、破坏，核酸和蛋白质类物质释放，细胞通透性增加，从而影响细胞功能与形态，导致无乳链球菌死亡。