利用HS-SPME-GC/MS法分析横坑切梢小蠹危害细叶云南松诱导抗性挥发物质*

吴东山 贾 婕 陈 虎 颜培栋 徐荣勋 杨柳琴 杨章旗

(1.广西壮族自治区林业科学研究院 广西马尾松工程技术研究中心 南宁 530002；2.广西国有雅长林场 乐业 533200)

植物在进化过程中对昆虫的胁迫会形成一套独特的防御机制，在这一过程中，植物通过调节自身次生代谢产物及营养物质的变化等一系列反应来抵御昆虫的危害。因此，植物的次生代谢物质常被看作是一种潜在抗性因素(郑宏，2013)。萜烯类化合物(Terpenes)是针叶树中重要的抗虫性物质，分泌含有高浓度萜类的挥发物抑制昆虫取食或使昆虫中毒是针叶树抗虫的主要手段(Louetal.，2000)。油松 (Pinustabulaeformis)、马尾松(Pinusmassoniana)、华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)3种松树在受到松毛虫中等程度危害后，针叶中昆虫生存所必需的氨基酸(Amino acid)、脂肪酸(Fatty acid)、萜烯类环氧化合物(Terpene epoxides)等物质减少，寄主能迅速产生诱导抗性抵御昆虫的进一步入侵(戈峰等，2002)。植物次生代谢物质在防御昆虫的侵害中起到重要的作用(Carmonaetal.，2011)。因此，研究植物次生代谢物质在不同受害个体中的变化规律，有助于更好地揭示植物体对昆虫胁迫防御机制的形成过程。

细叶云南松(Pinusyunnanensisvar.tenuifolia)是产于云南、贵州、广西交界的南盘江及红水河上游干热河谷地带云南松的一个地理变种，也是一个生态、经济效益很高的优良用材、产脂树种，在干热河谷退化生态系统植被恢复中具有重要价值。由于该区域特殊的地理位置，常年焚风肆虐，形成干热河谷生态环境，各类昆虫尤其是横坑切梢小蠹(Tomicusminor)(鞘翅目Coleoptera：小蠹科Scolytidae)的危害是细叶云南松天然林资源处于濒临灭绝的主要原因(吴东山等，2016)。横坑切梢小蠹的危害从幼虫蛀食嫩梢及针叶开始，成虫期侵入树干蛀成横切坑道，切断树干韧皮部水分和养分输导，加速松树死亡(李丽莎等，2006)。目前主要的防治方法仍是依靠人工清理以及化学药剂辅助，依然缺乏安全、环保的防治技术(徐长山等，2004)。因此，有必要从松树本身对昆虫危害的防御机制角度探讨新的防治技术。迄今为止，学者们的研究主要在云南松(Pinusyunnanensis)松针挥发物方面(丁靖凯等，1987；殷彩霞等，2002)，而南盘江及红水河上游流域的细叶云南松受横坑切梢小蠹危害与松针挥发物的关系，尤其是松针挥发物的特异性是否为诱导松小蠹选择寄主的决定因素的研究尚未见报道。本研究应用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry,HP-SPME-GC/MS)研究细叶云南松对横坑切梢小蠹危害的防御反应机制，以及危害程度与松树松针挥发物的变化关系，探讨其与抗虫性有关的挥发化学物质，可为筛选、培育抗虫品种及综合防治该害虫提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

按照横坑切梢小蠹虫危害程度分级标准进行嫩梢样品采集。A.轻度危害：嫩梢及针叶30%以下被蚕食、针叶淡绿色；B.中度危害：嫩梢及针叶31%～50%被蚕食、针叶黄绿色；C.重度危害：嫩梢及针叶51%以上被蚕食、针叶黄褐色;D.对照(虫害期间无机械损伤的健康植株)。

取样方法与处理：在广西乐业县雅长林场林区不同受害程度和对照的植株中各选4株，选择每个等级材料每株树冠中上部东、南、西、北4个方向上直径为2～3 cm的受害和对照嫩梢(每个等级材料重复采集混合样品3次)，用小刀直接将其外皮和韧皮部及其附带针叶削下组成样品，迅速放入50 mL具塞离心管中密封后，放入加有冰袋的保温箱保存。

1.2 顶空固相微萃取条件优化单因素试验

使用健康的细叶云南松枝梢对照材料进行SPME条件优化试验。采用单个因素逐步优化的方法(Steffenetal.，1996)对萃取头类型、萃取温度和萃取时间进行优化。取嫩梢针叶样品0.3 g研碎，置于配有聚四氟乙烯胶垫的顶空瓶(规格15 mL，中国上海安谱科学仪器有限公司)中，密封瓶口。将其置于 90 ℃ 水浴锅内预热 5 min 后，采用手动 SPME 进样器(美国 Supelco 公司)，将老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，吸附 30 min 后抽回，立即插入 GC-MS 联用仪的气相色谱进样口，于 250 ℃解吸 3 min，进行数据采集分析。

根据极性及涂层厚度的不同，采用的萃取头(产地：美国，Supeclo公司)有50/30 μm碳分子筛/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(PDMS/CAR/DVB)、75 μm 碳分子筛 /聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)4种类型；萃取温度分别为45、55、65、75、85 ℃5个梯度；萃取时间为10、15、20、25、30 min 5个梯度；测试的平衡时间点为0、5、10、15、20 min共5个梯度。正构烷烃混标(C8—C20，上海 Sigma-Aldrich 公司)。根据不同梯度下色谱峰的总面积确定萃取头类型、萃取温度和时间的优化条件。

1.3 挥发化学物质测定的GC-MS 分析条件

气相色谱仪(5973，美国，安捷仑公司)GC条件:色谱柱为BP-20(30.0 m×250 μm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱,柱温60 ℃(保留2 min)，以5 ℃· min-1升温至240 ℃,保持20 min;进样口温度250 ℃;载气为高纯He(99.999%);柱前压0.035 MPa,载气流量1.0 mL·min-1;进样量1 μL;采用不分流模式进样。

质谱仪(6890，美国，安捷仑公司)MS条件:离子源为EI源;离子源温度250 ℃;四极杆温度180 ℃;电子能量70 eV;发射电流34.6 μA;倍增器电压1 982 V；接口温度280 ℃;质量范围10～450 u。通过HPMSD化学工作站，结合Nist98标准质谱图、Wiley275质谱图库和部分标准样品谱图进行定性，按峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS19.0 版软件进行差异显著性分析及判别分析，采用 Kruskal-Wallis检验进行非参数检验。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME 条件优化

2.1.1 不同固相萃取头对萃取效果的影响 4种固相微萃取头的萃取结果如图1所示。具有极性和非极性涂层的CAR/DVB/PDMS萃取头吸附的挥发组分总峰面积最大，其次是CAR/PDMS，而PDMS的涂层不具有极性和非极性的特性，难以吸附挥发物中许多极性差异较大的物质，故吸附范围较窄，仅为CAR/DVB/PDMS效率的57.58%。可见，细叶云南松虫害嫩梢中的挥发性物质是极性与非极性物质的混合体，且各组分之间具有极性差异大的特征。因此，确定CAR/DVB/PDMS萃取头用于本试验，以获得更多挥发性组分。

图1 固相微萃取头对挥发成分萃取总峰面积比的影响Fig.1 Effect of SPMH fibres on total peak area ratio of volatile components extraction

2.1.2 不同平衡时间对萃取效果的影响 如图2所示。随着平衡时间的增加，挥发物的总峰面积呈先升后降的变化，在15 min时，顶空已基本达到平衡。

图2 平衡时间对挥发成分萃取总峰面积的影响Fig.2 Effect of equilibrium time on total peak area ratio of volatile components

2.1.3 不同温度对萃取效果的影响 采用CAR/DVB/PDMS萃取头，研究不同温度对萃取效率的影响，结果如图3所示。随着萃取温度的增加，萃取头的吸附量先降后升，在75 ℃时吸达到最大值，之后随着温度升高，吸附量又有所降低。这表明细叶云南松嫩梢挥发物中低沸点的组分较多，且含量也较大，为了防止萃取温度过高导致挥发性组分发生化学结构的转变影响实验结果，选择萃取温度为75 ℃。

图3 萃取温度对挥发成分萃取总峰面积的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on total peak area ratio of volatile components

2.1.4 不同吸附时间对萃取的影响 采用CAR/DVB/PDMS萃取头，在三相平衡时间达到15 min及萃取温度达到75 ℃条件下研究吸附时间对萃取效率的影响，结果如图4所示，在最优萃取温度下，随着萃取时间的增加，挥发峰面积不断增加，但时间越长，挥发组分含量反之下降，在15 min时总峰面积已经达到最大，说明细叶云南松嫩梢中的挥发物质已经达到吸附与解析的平衡状态。故选择15 min吸附时间为最优条件。

图4 吸附时间对挥发成分萃取总峰面积的影响Fig.4 Effect of absorption time on total peak area ratio of volatile components

2.2 细叶云南松虫害嫩梢挥发成分的差异分析

在75 ℃固相萃取仪上平衡15 min，用75 μm萃取头(DVB/CAR/PDMS)萃取15 min后，经 GC-MS 分析，得到总离子流图如图5所示，检出的挥发物成分及相对含量如表1所示。

图5 细叶云南松嫩梢挥发成分的总离子流图Fig.5 Total ion flow map of volatile components in tender shoots of Pinus yunnanensis var. tenuifolia

由表1可知，不同类型的细叶云南松嫩梢受到虫害后分离得到的化学成分不同，主要包括碳氢类化合物(hydrocarbons)、醇类(alcohols)、醛类(aldehyde)、酮类(ketones)、酯类(esters)以及环氧化合物(epoxy compound)。碳氢类化合物、醇类是挥发成分的主要物质，两者占总物质的87.7%以上，2类化合物的含量均随危害程度加深而增加。醛类和酮类占比最少，均低于0.1%。重度危害C类嫩梢分离鉴定出的挥发物质最多，达到50种，占总离子流出峰面积的96.364%，其中，碳氢化合物(共29种)占总峰面积的87.12% ，醇类物质(11种)占6.626%，、醛类物质(1种)占0.057% ，酯类物质(8种)占1.863%，环氧化合物质(2种)占 0.55%。所有嫩梢类型挥发物中仅有未受害植株检测到长叶烯成分，其含量为0.123%。

挥发物中含氧化合物含量不同，其抗性也有所不同。从表1可知，各类型嫩梢的挥发物质中的含氧化合物含量和数量也存在差别，重度危害嫩梢中的单萜类及倍半萜类含氧化合物种类最多，其含量也是最高的，分别达到2.117%、7.274%，而倍半萜类含氧化合物所占比例远高于单萜类型，结合危害程度及其挥发物中的含氧物质含量可以看出，危害程度越重，2种类型含氧物质含量越多。

表1 细叶云南松嫩梢挥发物成分及相对含量的 GC-MS 分析①Tab.1 GC-MS analysis of volatile components and relative contents in tender shoots of Pinus yunnanensis var. tenuifolia

不同类型嫩梢中含量大于1%的主要成分是：α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯、异松油烯、β-榄香烯、β-石竹烯、β-毕澄茄烯、甘香烯、γ-杜松烯、δ-杜松醇。为研究挥发物中主要成分的差异对嫩梢的抗性产生的作用，将各危害类型嫩梢与对照进行显著性差异比较，见表2。

表2 不同危害梢主要挥发成分含量差异显著性分析①Tab.2 Analysis of contents of main volatile components in young shoots with different damagements

由表2可知，从嫩梢挥发物主要成分的变化规律上看，细叶云南松嫩梢受到切梢小蠹危害的应激反应主要表现在萜类次生代谢含量上的不同。其中单萜类的α-蒎烯(X1)、3-蒈烯(X3)以及倍半萜中的β-榄香烯(X6)的含量在重度危害类型上与对照有显著差异，β-蒎烯(X2)、β-石竹烯(X7)、β-毕澄茄烯(X8)含量在重度及中度危害类型上与对照有显著差异，其余组分含量与未受害对照差异不显著。另外，在对挥发组分与对照有显著差异的分析中发现，随着危害程度的加重，α-蒎烯、3-蒈烯、β-石竹烯、β-毕澄茄烯的含量随之增加，仅有β-蒎烯含量逐渐减少。在重度危害类型中，β-蒎烯含量最低，仅为对照的47.85%，而3-蒈烯是含量上升比例最高的组分，其升高比例达62.83%，其次为β-石竹烯，增加26.76%，α-蒎烯含量仅增加10.91%。由此可见，挥发物中与对照存在显著差异的主要成分对嫩梢的抗性产生主导作用。

2.3 细叶云南松虫害嫩梢挥发成分的判别分析

为了分析挥发物主要差异成分与危害程度分组中的重要性依次关系，对挥发物主要成分指标进行判别分析，在兼顾到较少的样本量对分析产生的误差影响，结合Kruskal-Wallis检验对变量指标进行非参数检验。结果如表3所示。

结合表2的差异显著性分析结果及表3的F值检验可以看出，β-蒎烯(X2)、3-蒈烯(X3)、β-榄香烯(X6)、β-石竹烯(X7)、β-毕澄茄烯(X8)在中度、重度及对照组别中具有显著的差异，经过Kruskal-Wallis非参数修正检验也得到与显著性分析相同的结论。最佳判别函数变量组合是β-蒎烯(X2)、3-蒈烯(X3)、β-榄香烯(X6)、β-石竹烯(X7)、β-毕澄茄烯(X8)。判别函数组如下：

F1=314.365X2-4 772.047X3-11 284.045X6-
8 543.329X7-5 505.857X8-30 455.259;
F2=295.842X2-3 998.851X3-11 944.335X6-
9 004.377X7-5 118.902X8-30 884.551;
F3=356.258X2-4 148.387X3-11 747.702X6-
8 848.341X7-5 758.774X8-30 224.547。

对判别函数检验，具有显著性(P=0.023)，对表1中的12株松树的不同危害程度判别分组正确率为100%。F1、F2、F3分别代表中度、重度及对照组，将每一个观察值代入3个判别函数，以函数的大小作比较，函数值最大值，表明该对象属于该组。如果依据F大小，6个指标的重要性依次为：β-蒎烯(X2)、β-榄香烯(X6)、3-蒈烯(X3)、β-石竹烯(X7)、β-毕澄茄烯(X8)。

3 讨论

细叶云南松是云南松的一个地理变种，在植物分类学中两者属于同一物种，两者的次生代谢产物也存在着许多共性，它们的挥发成分主要成分为萜烯类、醇类、醛类、酮类、酯类及环氧衍生化合物等大部分分子量低于200的物质。对阔叶及松针类等用材类的叶梢其韧皮组织中挥发物的萃取常采用水蒸气蒸馏法(杨燕等，2009；田玉红等，2012)，水蒸气蒸馏法-萃取法(信平等，2008；Muetal.，2007)会使活泼、容易受到温度等因素影响的萜类化合物热异构化或快速的挥发而损失。本研究在分析细叶云南松松梢挥发物成分中首次运用顶空固相微萃取法(head space solid-phase microextraction)，其具有重现性好、对样品无溶剂干扰、效率高等优点(Steffenetal.,1996)，避免了传统方法中温度以及有机溶剂的干扰，也提高了萃取效率，减少了化合物在萃取过程中的流失。通过调整萃取头、平衡时间、萃取温度、萃取时间等得出了实验优化条件为：在75 ℃固相萃取仪上平衡15 min，用75 μm萃取头(DVB/CAR/PDMS)萃取15 min，在此基础上得到了最大的萃取效率。这与利用顶空固相微萃取技术研究香椿嫩芽的效率(李聚英等，2011)相近。这也同时表明，顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术适用于松针挥发性成分的快速分析。

植物的挥发物质是植物与外界进行联系的一种重要的信息化合物，并且在昆虫-寄主识别过程中起主导作用(Lightetal.，2005；Pauletal.，1999)。细叶云南松梢中的萜类、醇类、醛类等挥发物质就是其与昆虫进行联系的信号物质，挥发物质的成分和含量的差异会对不同的昆虫产生或抑制或吸引的应激响应。通过分析不同危害程度的细叶云南松梢的挥发物成分及含量发现，受到重度危害的松梢其分泌出的挥发物质种类最多，且含量也达到最大。所有挥发物中碳氢类化合物含量最高，达到82.245%以上，其次为醇类物质。细叶云南松横坑切梢小蠹侵害松梢及松针中未检测到长叶烯成分，而正常松梢中却含有0.123%的长叶烯，这与马尾松松针挥发物含有较多的长叶烯成分的特征有所不同，而切梢小蠹危害马尾松的现象却较少发生。在研究切梢小蠹的寄主选择、取食危害等行为与云南松本种挥发物的关系中也发现类似情况，聚集信息化合物含量的差异对切梢小蠹成虫的活动起到重要的诱导作用(周楠等，2000)。由此推断长叶烯可能是细叶云南松抗松小蠹危害的挥发物之一。

不同类型松梢的挥发物中含有不同比例的含氧化合物，主要为醇类、醛类、酮类、酯类等，其含量在7.572%～9.225%之间，且倍半萜类含氧衍生物含量远高于单萜类含氧物，研究松梢挥发物含氧物质的含量与受害程度发现，危害程度加重时挥发物中的含氧化合物含量增加，这表明含氧物质增加抗虫性下降。这也许是因为挥发物中这些含氧的杂原子化合物，其本身能够产生典型的焙烤、坚果似的香气，且具有极高的香气强度和极低的香气阈值诱导松小蠹成虫寻找适合于攻击、繁殖的寄主材料(Schroeder，1987；Byersetal.，1987；曾茜等，2014)。

不同类型松梢的挥发物主要成分的含量差异也有所差别，其中α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、β-石竹烯、β-毕澄茄烯、β-榄香烯含量与对照比较在中度、重度类型松梢中达到显著差异水平，这些主要差异成分中单萜与倍半萜各有3个成分，但成分含量差异最大的是单萜中的β-蒎烯、3-蒈烯。且在重度危害类型中β-蒎烯含量最低，而3-蒈烯含量则达到最大值。挥发物中与对照存在显著差异的主要成分对嫩梢的抗性产生主导作用。这与相关学者研究α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯萜类调节松科(Pinaceae)害虫取食和产卵行为过程中扮演的重要信号作用结果相一致(孟昭军等，2008；宁眺等，2006；耿树香等，2006)。通过判别分析表明这些主要成分与危害程度关系依次为：β-蒎烯、β-榄香烯、3-蒈烯、β-石竹烯、β-毕澄茄烯。

4 结论

切梢小蠹危害细叶云南松挥发性物质以重度危害检测出的组分最多，其中主要为萜烯类、醇类物质。主要代谢挥发产物与其受危害程度密切相关，随着受害程度的增加，单萜类物质中的主要组分及含量差异显著。单萜类及倍半萜类含氧衍生物总量随受害程度增加而增加，含氧化合物增多则其抗虫性减弱。3-蒈烯、β-蒎烯、β-榄香烯、β-石竹烯和β-毕澄茄烯含量差异是导致细叶云南松诱导横坑切梢小蠹虫抗性的主要原因。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术适用于松针挥发性成分的快速分析，本文通过对细叶云南松上横坑切梢小蠹危害的松梢中的挥发性成分进行分析及评价，为细叶云南松小蠹诱导抗性物质研究及其防治提供了科学参考。