MTHFR基因多态性与脊髓亚急性联合变性的相关性分析

陈静非，徐志昊，高媛雪，李建刚，鱼 海，张建军，侯瑞华

(宝鸡市中心医院神经内科，陕西宝鸡 721000)

脊髓亚急性联合变性（subacute combined degeneration，SCD）是一种主要累及脊髓侧索和锥体束的神经系统变性疾病，临床上多表现为双下肢深感觉缺失、感觉性共济失调、痉挛性瘫痪及周围性神经病变。长期以来，维生素B12（vitamin B12，VitB12）缺乏被认为是本病最主要的致病原因，其机制在于VitB12 参与神经系统甲基化过程，可影响髓磷脂合成，长期缺乏会导致神经脱髓鞘及轴索变性改变[1-2]。但是，临床工作中常发现部分SCD 患者无确切VitB12 缺乏证据，提示可能还存在其他潜在致病原因。有研究发现SCD 患者血清同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平显著升高[3]，而Hcy 水平过高可反馈性抑制甲基化过程[4]。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢通路的关键酶之一，为Hcy提供甲基形成甲硫氨酸。近年来，相继有研究发现MTHFR 基因存在多个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点可影响MTHFR 正常生理功能，进而影响机体Hcy表达和代谢[5-8]。本研究将观察SCD 患者血清VitB12，叶酸、Hcy 和MTHFR 基因多态性的关系，旨在探讨MTHFR 基因多态性与SCD 发病的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 连续性选择2017年1月～2020年7月于宝鸡市中心医院神经内科诊治的85 例SCD 患者作为病例组，其中男性49 例，女性36例，平均年龄56.77±10.82 岁。纳入标准：①年龄≥18 岁；②SCD 诊断参考HEMMER 等[9]提出的诊断标准。排除标准：①血清检测前3月内应用过VitB12 和（或）叶酸治疗；②并发严重肝肾功能障碍、恶性肿瘤等；③妊娠期妇女。选择同期于我院体检的健康志愿者100 例作为对照组，其中男性55 例，女性45 例，平均年龄57.03±9.66 岁，对照组成员均接受详细问诊排除脊髓疾病可能。病例组和对照组性别、年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂 7900 HT 型荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司），Unicel Dxl 800 Access 免疫分析系统（美国Beckman Coulter 有限公司），日立7170A 分析仪（日本日立有限公司），VitB12 及叶酸检测试剂盒（美国贝克曼库尔特有限公司），Hcy 检测试剂盒（北京康思润业生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因多态性检测：本研究采用荧光定量PCR 法检测MTHFR 基因C677T 和A1298C 位点多态性。引物均购至生工生物工程（上海）股份有限公司，C677T 位点上游引物：5’-GAA AAGCTGCGTGATGATG-3’；下游引物：5’-TTGA AGGAGAAGGTGTC-3’。A1298C 位点上游引物：5’-AAGAACGAAGACTTCAAA-3’； 下游引物：5’-TGGGGGGAGGAGCTGAC-3’。将PCR 扩增产物移至荧光定量PCR 仪上读取样品孔中的终点荧光，利用分析软件确定各样本的基因型结果。

1.3.2 血清VitB12，叶酸和Hcy 水平检测：所有研究对象在接受VitB12 治疗之前空腹采集5ml 静脉血，3 000 r/min，离心5 min。血清VitB12 和叶酸均按化学发光免疫法进行检测；血清Hcy 则按循环酶法进行检测。本研究定义血清VitB12浓度＜180pg/ml 为VitB12 缺乏、血清叶酸浓度＜3.1 ng/ml为叶酸缺乏、血清Hcy 浓度＞15μmol/L 为高Hcy。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 统计软件分析处理，计数资料结果以构成百分比表示，组间比较采用χ2检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律检验。多因素分析采用二元Logistic 回归分析法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较 见表1。病例组贫血、VitB12 缺乏和高Hcy 发生率均高于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.01）。

表1 两组基线资料比较[n(%)]

2.2 两组MTHFR 基因C677T 和A1298C 位点基因型和等位基因分布频率比较 见表2。研究对象C677T 和A1298C 位点上的基因型和等位基因分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（均P＞0.05），具有群体代表性。两组C677T 和A1298C 位点基因型和等位基因分布频率差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 两组MTHFR 基因C677T 和A1298C 位点基因型分布和等位基因频率比较[n(%)]

2.3 两位点不同基因型与血清VitB12，叶酸和Hcy 水平的关系 见表3，表4。MTHFR 基因C677T 位点和A1298C 位点不同基因型人群VitB12 缺乏和叶酸缺乏发生率差异均无统计学意义（均P＞0.05）；两位点不同基因型人群高Hcy 发生率差异具有统计学意义（均P＜0.01）。

表3 C677T 位点不同基因型与血清VitB12，叶酸和Hcy 水平的关系[n(%)]

表4 A1298C 位点不同基因型与血清VitB12，叶酸和Hcy 水平的关系[n(%)]

2.4 多因素分析 见表4。采用二元Logistics 回归法分析SCD 发病的独立危险因素，以单因素分析P＜0.05 的参数为自变量，包括贫血、VitB12 缺乏、高Hcy，C677T 位点TT 基因型和A1298C 位点CC基因型，但由于Hcy 升高是MTHFR 基因突变的直接结果，故从自变量中剔除；以SCD 发病为因变量，结果显示携带C677T 位点TT 基因型是SCD 发病的独立危险因素（OR=2.768，95% CI：1.487～5.516，P=0.005），A1298C 位点基因多态性与SCD 发病无明确相关性（OR=2.190，95% CI：0.958～5.004，P=0.067）。

表4 SCD 易感性的多因素分析

3 讨论

目前，多数研究一致认为早期诊断和及时治疗是改善SCD 预后的关键因素，一般在发病的前三个月内经积极治疗和康复锻炼，SCD 患者预后相对较好，部分患者甚至可达到完全恢复，而当进展到病程后期时，即使给予相应治疗，仍然疗效欠佳，多数患者可能遗留的部分神经功能障碍不能恢复[10]。因此，对可疑SCD 患者在发病早期及时筛查和治疗对患者预后具有重要临床意义。长期以来，VitB12 缺乏仍是SCD 最为公认的假说之一，本研究结果同样显示病例组患者血清VitB12 平均水平显著低于对照组。但临床中经常出现部分SCD 患者无确切VitB12缺乏证据，甚至因此贻误诊治时机，影响患者预后。因此，继续深入探讨该病发病机制和分子遗传学背景具有重要的临床价值。

近年来，多个研究结果表明高Hcy 可能与SCD发病相关，其机制尚未明确，可能在于Hcy 过多蓄积会反馈性抑制机体甲基化反应，继而导致核酸代谢和髓鞘合成受损[3-4,10]。MTHFR 是参与Hcy 转化为蛋氨酸的关键酶，其在DNA 合成和甲基化过程中也起着重要作用[13]。C677T（rs1801133）和A1298C（rs1801131）是MTHFR 基因最常见的SNP位点，研究显示携带突变基因个体的MTHFR 酶活性可明显降低。因此，研究认为C677T T 等位基因和A1298C C 等位基因与DNA 甲基化减少和Hcy浓度增加有关[5]。目前已有多项研究发现C677T 和A1298C 基因多态性与各类疾病有关，如出生缺陷、阿尔茨海默病、卒中、恶性肿瘤等[5,13-14]。近期一项研究以中国北方汉人为研究对象，结果显示携带C677T TT 基因型可增加SCD 患病风险，但该研究仅纳入31 例SCD 患者，且仅观察C677T 一个SNP位点[15]。此外，既往研究表明不同地区、种族人群MTHFR 基因多态性位点基因型分布频率存在明显差异，如欧洲和北美人群C677T 位点TT 纯合子频率为5%～15%，远低于中国人20%～25%[16-17]。在国内不同地域不同民族之间，两位点基因型分布和等位基因频率也不一致，有荟萃分析结果显示以秦岭-淮河为界，中国北方人群C677T TT 基因型和T 等位基因频率均高于南方人群，而A1298C CC 基因型和C 等位基因分布频率均低于南方人群[18]。因此，有必要继续开展相关研究以验证和进一步探讨MTHFR 基因多态性与SCD 的相关性。

本研究结果显示携带C677T 位点TT 基因型可显著增加SCD 发病风险（OR=2.768，95% CI：1.487～5.516，P=0.005），与ZHANG 等[15]研究结果相符。同时，本研究还发现C677T 位点不同基因型之间高Hcy 发生率存在显著差异，尤其携带TT基因型人群显著高Hcy 发生率高于CC 基因型人群，验证了本研究的前期推测，即MTHFR 基因突变可导致MTHFR 酶活性下降，进而降低5-亚甲基四氢叶酸浓度，抑制Hcy-甲硫氨酸再甲基化，导致Hcy 在体内不断蓄积，使核酸代谢和髓鞘合成受损，导致SCD 发病。此外，本研究结果还显示A1298C位点不同基因型之间高Hcy 发生率也存在显著差异，但本研究未发现该位点基因多态性与SCD 明显相关，一方面可能与该位点突变基因频率偏低，样本量相对较少，检验效能不足有关，另一方面也表明了SCD 发病机制的复杂性。

综上所述，本研究发现在陕西地区汉族人群中，MTHFR C677T 多态性与SCD 易感性密切相关。本研究还有一定的局限性：首先，由于SCD 患病率相对较低，本研究纳入的样本量偏少。其次，如前所诉，不同地域不同民族患者该基因两位点多态性分布频率均存在一定差异，因此有必要继续在多区域开展研究。第三，SCD 的其他潜在危险因素，包括其他MTHFR 多态性，需要进一步研究。最后，本研究未就MTHFR 基因多态性与神经功能障碍严重程度和预后进行观察，也需要进一步阐明。