冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清骨形态发生蛋白4，N1-甲基烟酰胺和血管生成素样蛋白8水平检测的临床意义

关小明，陈 锴，王文会

(佛山市中医院 a.检验科;b.内科;c.心血管内科 ,广东佛山 528000)

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称为冠心病（coronary heart disease，CHD），是心血管疾病中最常见的致死疾病。我国CHD 的患病数约1 100 万，死亡率约为140/10 万，并且发病率及患病率有不断升高的趋势，严重威胁我国人民的健康[1]。CHD常见的危险因素包括高血压、糖尿病、高血脂等，多种因素共同作用，损伤冠状动脉血管内皮细胞，导致动脉粥样硬化的发生[2]。深入研究反映冠脉狭窄程度及病变程度的血清学指标，有助于CHD 的早期诊断及治疗效果的评估。血清骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP-4）属于转化生长因子β 家族成员，研究表明，BMP-4 不仅具有促进成骨的功能，在调控胚胎分化发育、肿瘤发生发展及心血管疾病中均发挥重要的功能[3,4]。N1-甲基烟酰胺（N1-methylnicotinamide，me-Nam)是一种烟酰胺的代谢产物，烟酰胺N-甲基转移酶（nicotinamide N-methyltransferase，NNMT）可催化甲基从s-腺苷甲硫氨酸向烟酰胺的转移，产生me-Nam 和s-腺苷同型半胱氨酸。研究显示，人类血清me-Nam 活性增加与肥胖、糖尿病及CHD 有关，由于肥胖和糖尿病是CHD 发展的危险因素，因此血清me-Nam 水平升高可能参与动脉粥样硬化的发生发展[5]。血管生成素样蛋白8（angiopoietin like 8，ANGPTL8）编码基因位于19p13.2，是一种由肝脏分泌的促炎因子，在CHD 等心血管疾病中存在ANGPTL8 表达上调的现象，其可通过抑制脂蛋白脂肪酶的活性促进动脉粥样硬化的进展[6]。但目前三者在CHD 中的表达情况及临床意义尚不清楚，本研究通过检测CHD 患者血清BMP-4，me-Nam 及ANGPTL8 水平，初步分析三者与血脂、炎症因子及冠脉病变的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2018年1月～2020年1月佛山市中医院收治的86 例CHD 患者为CHD 组。其中，男性53 例、女性33 例，平均年龄为53.61±5.63岁，平均体质量指数（body mass index，BMI）为25.72±3.15kg/m2，并发高血压史55 例，并发糖尿病史52 例，并发吸烟史33 例。CHD 组根据冠状动脉的狭窄程度和冠脉病变支数分为三个亚组，其中单支病变组（主要动脉有一支狭窄程度≥50%）25 例，两支病变组（主要动脉有两支狭窄程度≥50%）39 例及三支病变组（主要动脉有三支狭窄程度≥50%）22 例；CHD 组中稳定性冠心病21例、急性冠脉综合征（ACS）65 例，其中急性冠脉综合症（acute coronary syndromes, ACS）中包括不稳定型心绞痛47 例和急性心肌梗死18 例。此外，以同期我院健康查体的60例受试者为对照组，其中，男性32 例、女性28 例，平均年龄为54.93±5.30 岁，平均BMI 为24.93±4.21kg/m2，并发高血压史28 例，并发糖尿病史23 例，并发吸烟史30 例。CHD 组与对照组在年龄、性别、BMI，吸烟史之间相比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。

CHD 组纳入标准：①CHD 的诊断结合患者的临床症状、心肌酶学检查、冠状动脉造影等检查，符合心血管病学分会介入心脏病学组制定的CHD诊断标准，即冠状动脉15 个不同节段中至少一个节段的管腔狭窄程度≥20%[7]；②CHD 患者及其家属对本研究知情同意并签字；③半年内无创伤手术史、心脏疾病治疗史等；④受试者签署知情同意协议。排除标准：①并发其他器官恶性肿瘤；②并发急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病；③近一个月有糖皮质激素、免疫抑制剂的用药史。

对照组纳入标准：①既往无CHD 症状及CHD病史；②半年内无创伤手术史、心脏疾病治疗史等。排除标准：并发其他器官恶性肿瘤、急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病；③近期有糖皮质激素、免疫抑制剂的用药史。

1.2 仪器和试剂 BMP-4，me-Nam 和ANGPTL8检测试剂盒均购自上海颖心生物科技公司（货号YX80322B，YX80061B 及TX21792）；Beckman Coulter AU5800 全自动生化分析仪及配套试剂盒检测血生化指标。

1.3 方法

1.3.1 检验方法:患者于治疗前、体检者于体检当日取清晨空腹静脉血5ml，以3 000r/min 离心10min，离心半径10cm，取上层血清置于冻存管中，并于-20℃保存，采用酶联免疫吸附法检测所有研究对象血清中的BMP-4，me-Nam 和ANGPTL8 水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。应用氧化酶法检测总胆固醇（total cholesterol，TC），三酰甘油（triacylglycerol，TG）水平；应用酶法检测高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C），低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；应用乳胶凝集反应法检测超敏C 反应蛋白（high sensitivity C reactive protein，hs-CRP）水平，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平检测采用酶联免疫吸附实验进行。

1.3.2 冠状动脉狭窄程度评价方法:所有患者进行冠状动脉造影检查，检查成功后采用Gensini 积分系统对冠状动脉狭窄程度进行评价[7]，Gensini 积分=Gensini 评分×各段系数。根据Gensini 积分将CHD 组患者进行分组，Ⅰ组（4～8 分）14 例，Ⅱ组（9～12 分）24 例，Ⅲ组（13～33 分）27 例，Ⅳ组（34 分及以上）21 例。

1.4 统计学分析 使用SPSS23.0 进行研究资料分析。观测资料中的计量数据，均通过正态性检验，以均数±标准差（±s）描述。两组间的比较为成组t检验或校正t检验（统计量为t）。多组间的比较为单因素方差分析（统计量为F）+两两比较HSD-q检验（统计量HSD-q）。趋势检验为两分类转化后的Cochran Armitage 趋势检验（统计量为Cochran Armitage 趋势χ2）。此外，相关分析为Pearson 相关检验，ROC 曲线分析血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及联合检测对CHD 组患者的诊断价值。统计推断的检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CHD 组与对照组血脂及炎症因子水平比较见表1。与对照组相比，CHD 组患者TC，TG，LDL-C，IL-6，TNF-α 及hs-CRP 明显较高，HDL-C明显较低，差异具有统计学意义（均P<0.05）。

表1 CHD 组与对照组血脂及炎症因子水平比较（±s）

表1 CHD 组与对照组血脂及炎症因子水平比较（±s）

项 目CHD 组(n=86)对照组(n=60)t 值P 值TC（mmol/L）6.73±0.864.30±0.7217.9330.000 TG（mmol/L）1.51±0.341.03±0.269.6560.000 LDL-C（mmol/L）4.82±0.812.53±0.7017.7530.000 HDL-C（mmol/L）0.96±0.411.32±0.325.9500.000 IL-6 (pg/ml)8.18±2.212.73±0.7318.3980.000 TNF-α(pg/ml)9.24±2.534.52±0.4014.3120.000 hs-CRP（mg/L）1.87±0.350.71±0.1328.0840.000

2.2 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini积分对比 见表2，表3。与对照组相比，CHD 组患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平明显增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。三支病变组患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8，Gensini 积分明显高于单支及双支病变组患者，双支病变组患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8，Gensini 积分高于单支病变组患者，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 CHD 组与对照组血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 积分对比（±s）

表2 CHD 组与对照组血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 积分对比（±s）

项 目对照组（n=60）CHD 组（n=86）t 值P 值BMP-4（μg/L）3.12±1.276.67±1.7514.201 0.000 me-Nam（ng/ml）5.21±1.439.74±2.6013.495 0.000 ANGPTL8（μg/L） 150.33±29.63 502.12±79.34 37.538 0.000 Gensini 积分-32.73±6.10--

表3 不同狭窄程度组血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 积分对比（±s）

表3 不同狭窄程度组血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 积分对比（±s）

注：*与对照组相比，P<0.05；#与单支病变组相比，P<0.05；&与双支病变组相比，P<0.05。

指标对照组（n=60）单支病变组（n=25）双支病变组（n=39）三支病变组（n=22）差异分析趋势分析FPχ2P BMP-4（μg/L）3.12±1.275.18±1.35*6.24±1.57*#9.13±2.14*#&93.6960.00080.9760.000 me-Na(ng/ml）5.21±1.438.31±2.71*9.79±2.50*#11.30±2.83*#&55.5150.00075.6880.000 ANGPTL8(μg/L）150.33±29.63468.94±84.72*503.34±75.81*#537.66±81.94*#&359.2590.000108.6410.000 Gensini 积分-25.73±7.1334.73±6.11#37.14±8.05#&--

2.3 不同冠状动脉狭窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比较 见表4。随着Gensini积分升高，CHD 患者的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 有逐渐升高的趋势（均P＜0.05）。

表4 不同冠状动脉狭窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比较（±s）

表4 不同冠状动脉狭窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比较（±s）

注：*与Ⅰ组比较，P ＜0.05；#与Ⅱ组比较，P ＜0.05，&与Ⅲ组比较，P ＜0.05。

指标Ⅰ组（n=14）Ⅱ组（n=24）Ⅲ组（n=27）Ⅳ组（n=21）差异分析趋势分析FPχ2P BMP-4(μg/L）5.25±1.036.04±1.13*6.81±1.11*#8.16±1.14*#&22.7920.00026.6820.000 me-Nam(ng/ml）7.22±1.828.73±1.97*10.09±2.03*#12.09±2.19*#&18.9280.00018.9550.000 ANGPTL8(μg/L)343.01±89.06420.54±74.75*564.57±79.12*#623.46±80.85*#&48.3340.00049.2520.000

2.4 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8水平与血脂、炎症因子和Gensini 积分的相关性 见表5。CHD 组患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 表达与Gensini 积分, TC, TG, LDL-C, IL-6, TNF-α 及hs-CRP 呈正相关，与HDL-C 呈负相关（均P<0.05）。

表5 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平与血脂、炎症因子和Gensini 积分的相关性

2.5 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8表达的相关性 Pearson 线性相关分析结果CHD患者血清BMP-4 表达与me-Nam，ANGPTL8 表达呈显著正相关（r=0.567，0.610，P=0.000，0.000），me-Nam 与ANGPTL8 的表达呈显著正相关（r=0.562，P=0.000）。

2.6 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及联合检测对CHD 的诊断价值 见图1。血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及联合检测的敏感度分别为70.3%，75.3%，78.6% 及87.3%，特异度分别为63.1%，72.2%，70.9%及62.4%。ROC 曲线分析显示，血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及联合检测的曲线下面积分别为0.707（95%CI:0.601～0.812），0.713（95%CI:0.612～0.833），0.759（95%CI:0.667～0.850）及0.847（95%CI:0.722～0.908），联合诊断的诊断效能大于任一单一指标的诊断效能。

图1 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及联合检测对CHD 的诊断价值

3 讨论

CHD 是严重威胁人类健康的心血管疾病，近年来随着我国经济发展水平的提高及人口老龄化的加剧，其发病率不断升高[8]。病理上，CHD 主要表现为动脉粥样硬化及粥样硬化斑块的形成，伴有血管内皮细胞的损伤、单核巨噬细胞的浸润及泡沫细胞的形成。CHD 的发生和促炎与抗炎系统平衡失调有关，涉及血清白介素、基质金属蛋白酶等多种炎症及炎症因子的异常改变，导致血管内皮细胞的增殖、血管胶原蛋白的降解，促进CHD 的发生发展[9]。因此，有必要寻找反映CHD 病情严重程度的血清标志物，探讨其在CHD 发病中的作用，为CHD 的早期诊断、风险评估及治疗提供新的思路。

BMP-4 是骨形态发生蛋白家族成员，主要在脉管系统中广泛表达，近年来研究发现，BMP-4 是血管稳态和疾病的关键调节因子，BMP-4 能够促进血管内皮细胞氧化的作用，并导致一氧化氮依赖性血管舒张受损，引起内皮细胞功能障碍[10]。本研究中，CHD 组患者血清BMP-4 水平较对照组人群均明显升高，提示BMP-4 可能参与促进CHD 的发生发展。此外，CHD 患者冠状动脉狭窄程度越重或病变支数越多，血清BMP-4 水平越高。SUCOSKY等[11]学者报道，CHD 时血管内皮细胞处于氧化应激的状态，大量活性氧诱导BMP-4 的表达上调，BMP-4 作为一种促炎因子，能够结合白细胞表面的细胞间黏附分子1，促进白细胞的的黏附、聚集及活化，加重冠脉的病变程度，促进CHD 的病变进展。本研究中，BMP-4 与血脂相关指标TC，TG，LDL-C 及炎症因子IL-6，TNF-α 及hs-CRP 呈正相关，与HDL-C 呈负相关，表明BMP-4 还可能参与CHD 中脂质代谢的生物学过程。目前BMP-4 对脂质代谢调节的机制尚不清楚，WEI等[12]学者发现，BMP-4 能够诱导脂肪干细胞向成熟的脂肪细胞进行分化，发生CHD 时BMP-4 可能通过结合细胞表面的BMPR-IA 受体，激活下游信号通路，促进冠状动脉脂质浸润和内皮损伤，导致CHD 的病变进展。

me-Nam 作为一种反映尼克酰胺-N-甲基转移酶（NNMT）活性的血清学指标，主要在脂肪组织和肝脏中高表达，在其他器官组织中低表达。研究表明，肥胖症和2 型糖尿病小鼠和人类的NNMT活性增加，而肥胖和糖尿病是CHD 疾病发生发展的重要危险因素[13-14]。因此，可以推测CHD 患者血清me-Nam 水平可能影响CHD 的疾病进展。本研究中，CHD 患者冠状动脉狭窄程度越重或病变支数越多，血清me-Nam水平越高。MATEUSZUK等[15]研究证明，me-Nam 具有改善血管内皮细胞功能，抑制血小板活化和抑制炎症的作用，并且在载脂蛋白E/LDL 双敲除小鼠中显示出抗动脉粥样硬化作用。DOMAGALA 等[16]研究发现，me-Nam 能通过增加内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶介导的一氧化氮的释放来改善内皮功能障碍。因此，CHD 患者中血清me-Nam水平的增加可能作为一种防御反应，me-Nam 通过改善血管内皮功能障碍增加适应动脉粥样硬化的能力，导致动脉粥样硬化的程度不断加重。此外，me-Nam 水平与TC，TG，LDL-C，IL-6，TNF-α 及hs-CRP 呈正相关，与HDL-C 呈负相关，表明me-Nam 与CHD 中脂质代谢及炎症途径关系密切。PISSIOS 等[17]发现，me-Nam 通过抑制活性氧的产生而具有抗炎特性和抗血栓的特性，对动脉粥样硬化中内源性me-Nam 通路的激活能够抑制动脉粥样硬化的发生，因此CHD 中血清me-Nam表达升高可能作为一种炎症反应补偿机制，增强机体抗炎能力。

ANGPTL8 主要表达于肝脏及脂肪组织中，结构上缺乏C 端的纤维蛋白原样结构域，在N 端与ANGPTL3 和ANGPTL4 具有共同的卷曲螺旋结构域。研究表明，ANGPTL8 参与炎症调节、脂肪代谢、葡萄糖代谢及动脉粥样硬化等病理生理过程，并影响疾病的发生发展，可能是反映病情的重要标志物[18]。本研究发现，CHD 组患者血清ANGPTL8水平高于对照组，且血清ANGPTL8 水平与冠状动脉的狭窄程度、病变支数有关，可能是ANGPTL8能促进胆固醇吸收的主要受体巨噬细胞清除受体1的表达，促进巨噬细胞中胆固醇的摄取并抑制胆固醇外排，促进泡沫细胞的形成[19]。尚有研究发现，ANGPTL8 能够通过增加血浆TG 水平，促进动脉粥样硬化的发生[20]。本临床研究亦证实，CHD 组患者血清ANGPTL8 表达与血脂相关指标TC，TG，LDL-C 呈正相关，与HDL-C 呈负相关。因此，血清ANGPTL8 的高表达参与CHD 患者机体内脂质代谢的病理生理学过程，但具体机制有待深入研究。

本研究分析CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平的相关性，结果三者之间存在显著正相关，三者之间的相互关系目前尚不清楚，结合本研究，三者可能通过参与调节慢性炎症因子的产生，影响脂质代谢的生物学过程，导致CHD 病情的发生发展。本研究进一步分析三者对CHD 的诊断价值，结果联合检测对CHD 的诊断效能明显升高，表明联合检测可能有助于CHD 的早期诊断，值得临床深入探索。

综上所述，血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8水平在CHD 患者中表达升高，冠状动脉狭窄程度越重或病变支数越多，其水平越高，且三者与CHD 患者血脂、炎症因子有关，检测其水平可为CHD 病情评估提供一定参考。