TNF-α-308位点基因多态性与颞下颌关节紊乱病的相关性分析

王 璞 韦丽宾 周宏斌 段春巧 倪广晓

颞下颌关节紊乱病（temporomandibular disorder，TMD）是常见的疼痛性疾病[1]，主要影响咀嚼肌、颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）、和颞下颌关节相关联的肌肉。大约5%至15%的成年人受到TMD的困扰，女性患病率显著高于男性，发病年龄集中在20至40岁[2，3]。TMD的疼痛与社会心理因素、睡眠呼吸暂停、颌面部外伤史及疼痛敏感性相关[3，4]。TMD的病理生理学尚不明确，研究发现TMJ炎症、外周和中枢敏化、不受控制的自主神经系统刺激被认为是触发和维持TMD的主要危险因素[4～6]。TMD病理学的复杂和多因素性质表明，环境暴露和遗传因素定位多个基因可能参与了疾病的发生。尽管确切的病理生理机制仍然是未知的，但是可能涉及疼痛感阈值改变，神经内分泌和免疫系统失调，所有这些都可能有共同的遗传基因影响。

TNFA基因启动子区-308位点（TNFA-308G/A；rs1800629）的单核苷酸多态性可以调节炎症反应，TNF-α-308的产生增加很少与携带A等位基因有关。由于TNF-α与多种疼痛性疾病密切相关，并且TMD患者的TNF-α表达水平显著上调，本研究旨在探讨TNF-α-308位点（rs1800629）基因多态性TMD发病和压痛阈值的影响。

资料和方法

一般资料：选取自2019年3月～2019年11月就诊于河北医科大学第二医院口腔科的疼痛性TMD患者152例（男性56例，女性96例）作为试验组，平均年龄（45.2±6.9）岁，病程2.5～5.5周。选取182名性别和年龄匹配的健康受试者（男性18例，女性164例）作为对照组，平均年龄（42.8±7.5）岁，两组基线资料比较见表1。

表1 2组受试者基线资料比较

试验组入选标准和排除标准：入选标准：①符合国际牙科研究会2014年发布的TMD分类及诊断标准[3]；②初次发病；③伴有颞下颌关节区域疼痛；④签署知情同意书。排除标准：①患有头颈颌面部肿瘤；②患有中耳炎或牙痛；③既往颞下颌关节外伤或手术史；④头面部神经性病变。

压痛阈值测量方法：应用手持式压力测力计Algometer（美国MEDOC公司）测量受试者颞下颌关节、颞肌前束及咬肌的压痛阈值。受试者仰卧于椅位上，右手持反应器，将Algometer压力感应器的圆形探头按压于测试部位，校准速度为0.5kg/cm2/s，垂直于皮肤表面。当受试者感觉到疼痛时，立即按下反应器，测试者听到提示音后立即停止按压动作，以便设备自动记录压力大小。共测试3次，两次按压间隔120s，计算3次测试的平均值进行统计分析。压力测试结束后，所有参与者都接受咀嚼肌评估、颞下颌关节触诊和下颌运动范围评估。

基因检测方法：使用DNA Oragene OG-500试剂盒（加拿大）收集所有参与者的唾液。使用QIAamp DNA微型试剂盒（德国）从每个参与者的唾液中提取DNA。采用TaqMan qRT-PCR方法测定TNFA-308 DNA滴度，引物及探针合成由上海生工生物工程有限公司完成。引物设计软件为Primer Premier 5.0。TNFA-308上游引物：5'-AGGCATAGTTTTGAGGGCCAT-3'，下游引物：5'-TCTCCTGCTCTCCGATCG-3'，FAM标记的探针：5′-GAGGCAATAGGTTTTGAGGGCATG[A/G]GGACGGTTTC AGCCTCCAGG GTCC-3′。qRT-PCR反应是在5μl的反应混合物中进行的，该混合物含有20ng基因组DNA和2.5μl TaqMan基因分型聚合酶链反应主混合物。使用viia7平台（Applied Biosystems）进行扩增和检测。2步热循环过程，92℃15s，60℃60s，共45个循环。并使用SDS软件进行等位基因分析。

统计分析：应用Graphpad prism 6软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验。对计量资料进行正态性检验，正态分布数据组间比较采用t检验。非正态分布数据采用Mann-Whitney U检验。采用单因素方差分析评估各组之间和不同TNF-308基因型的压力疼痛阈值的差异比较，非正态分布数据比较采用非参数的秩和检验，基因型的危险因素通过优势比和95%可信区间计算等位基因。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

压痛阈值测定结果显示，观察组的颞下颌关节、颞肌前束及咬肌的压痛阈值均显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。（图1）。

图1 2组的压力痛阈值比较

2组的TNF-α-308位点基因类型和等位基因频率比较结果，观察组与对照组TNF-α-308位点的GG、GA、AA基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P＜0.05），具有群体代表性。TMD患者与对照组比较，TNF-α-308位点AA基因型频率和A等位基因频率的差异均不显著（P＞0.05），GA基因型频率差异显著（P＜0.05）。2组受试者TNF-α-308位点GA、AA、GA+AA基因型、A等位基因OR值及其95%可信区间（confidence interval，CI）分别为2.873（1.256～6.569）、1.616（0.4804～5.435）、2.454（1.212～4.698）和1.427（0.779～2.612）。TNF-α-308位点A等位基因（GA+AA）与TMD呈正相关（P＜0.05）。

不同基因类型TMD患者的压痛阈值测定结果显示，拥有A等位基因纯合子（AA）的TMD患者，颞下颌关节、颞肌前束及咬肌疼痛敏感性显著降低，与其他基因类型比较差异有统计学意义（P＜0.05）。G等位基因纯合子（GG）与A等位基因携带者（GA/GA+AA）相比较，颞下颌关节、颞肌前束及咬肌压痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

表2 2组TNF-α-308（rs1800629）基因型和等位基因频率比较

图2 按观察组不同基因型TMD患者的压痛阈值比较

讨 论

本研究首次揭示了TNF-α-308位点基因多态性与TMD的发生和疼痛程度的相关性。研究结果发现26.97%的TMD患者有罕见的A等位基因，在健康受试者中，只有13.18%的人有这种基因，优势比为2.454（95%CI，1.212～4968），A等位基因与TMD的发病密切相关。TMD患者拥有TNF-α-308位点GA基因型的比率明显高与对照组的健康受试者。TNF-α-308各基因类型与颞下颌关节、颞肌前束及咬肌疼痛阈值比较结果表明，在TMD患者中，携带A等位基因纯合子（AA）的TMD患者，颞下颌关节、颞肌前束及咬肌疼痛敏感性显著降低，拥有G等位基因纯合子（GG）与A等位基因携带者（GA/GA+AA）的颞下颌关节、颞肌前束及咬肌压痛阈值无明显差异。A等位基因的纯合性很少见，降低了发现与TMD相关的机会，然而，仅仅携带1个A等位基因就显著增加TMD的患病风险，但是，AA基因型的TMD患者对于压痛的敏感性显著降低。

TNF-α通过2种不同的细胞表面受体发挥作用，TNFR1（神经退行性变）和TNFR2（神经增殖性）。TNFR1主要存在与海马区，TNF-α-308 A等位基因的受试者海马体积较低-308 G/A多态性可解释为高水平的TNF-α，TNF-α在大脑的这一区域产生神经退行性作用[7，8]。动物实验研究发现，在大鼠的大脑海马区，TNF-α使其对压力有反应的区域敏感性降低[8～10]。TNF-α-308G/A多态性的影响可能不局限于颞下颌关节炎，而且还可能影响与认知、应激相关的更复杂病理生理学的肌肉疾病[11]。一项荟萃分析包括19项研究，2584名受试者，3254个对照组证实A等位基因和TNF-α-308位点AA/AG基因型于TMD有很强的相关性，该项研究也指出TNF-α-308基因可能与中枢敏化有关[12]。另一项研究显示TNF-α-308多态性相关基因表达上调可能导致对慢性疼痛的长期反应性脱敏，从而导致TMD受试者的压力痛阈升高[13]。

综上所述，多态性A等位基因TNF-α-308携带者患TMD的风险增加，并且TMD A等位基因纯合子的压力痛阈试验的疼痛敏感性降低。为了揭示遗传变异对TMD发病和发展的确切影响，需要大样本的TMD患者和合适的对照组进行纵向研究。