唾液细胞外囊泡miRNA辅助口腔鳞癌诊断与术后评估

叶伟龙 赵鹏程 马国武 孙 波

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤[1]，目前临床上诊断OSCC时将组织病理作为金标准，但是技术上存在滞后性、创伤性、静态性、偏倚性等局限。本实验对文献中提到的几种差异表达的miRNA，以实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测目标miRNA在OSCC患者组和健康组之间，以及OSCC患者手术前后的表达差异，旨在探讨miRNA作为OSCC患者术前的辅助诊断和术后疗效评估的参考生物标志物的应用前景。

资料和方法

一、材料患者纳入及主要试剂准备

受试者：依照伦理委员会的标准，从2017年5月到2018年11月，征得患方同意并收集共计17例口腔鳞癌患者术前的唾液，年龄分布为38～79岁，其中男性12例，女性5例。按发病部位分为5例舌部，4例唇部，4例口底，2例颊部，2例牙龈（表1）。所纳入病例的TNM分类均为T2N0M0。作为对照组，收集11位40～80岁的健康志愿者的唾液。此外还提取了6例患者血液，以及7例患者术后1～3月的唾液，以检测其细胞外囊泡miRNA表达变化。

表1 OSCC患者临床特点

主要试剂：苯甲基磺酰氟、DNase/RNase-Free Water购自北京索莱宝公司。广谱蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司。RIPA裂解液、pH＝6.8和pH＝8.8的1mM Tris-HCL缓冲液、30%丙烯酰胺、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自中国碧云天公司。SDS L5750、过硫酸铵7727-54-0、TEMED17-1312-01购自美国Sigma-Aldrich公司。Total Exosome Isolation Kit购自美国invitrogen公司。PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR® Premix Ex TaqTMII、RNAiso Plus9108购自Takara公司。miRNA检测外参购自中国天根公司。Cel-miR-39-3p的引物购自广州锐博公司。Hsa-miR-10b-5p、Hsa-miR-486-5p、Hsa-miR-512-3p、Hsa-miR-412-3p的引物购自上海吉玛公司。

表2 蛋白免疫印迹使用抗体及浓度

提取唾液细胞外囊泡：每日上午，受试者空腹平静状态下，无菌管吸取口内唾液1～2mL于离心管，冰上放置。按照试剂盒说明书，向离心管内加入等体积PBS溶液，移液器吹打均匀分装，4℃离心取上清液，以样本体积：试剂体积＝2∶1的比例加入提取试剂，4℃过夜后再4℃离心，弃上清液。加入PBS溶液溶解沉淀，-80℃储存备用。

透射电子显微镜（TEM）：取适量收集的细胞外囊泡样品置于封口膜上，夹取铜网置其上，样品沉降15min后用滤纸从铜网侧边轻轻吸干液体。取一定量3%磷钨酸于封口膜上，将吸干液体的铜网再置于其上负染5min，滤纸轻轻吸干染液，晾干后行透射电子显微镜检测。

总蛋白浓度测定：按照BCA试剂盒说明配制50：1工作液，将标准蛋白用PBS溶液稀释至0.5mg/ml。依次将0、1、2、4、8、12、16、20μL的梯度体积的标准蛋白分别加到96孔酶标板中，统一用PBS溶液补足到20μL。另在一孔中加入5μL待测样品与15μL PBS溶液。向每个酶标孔中加入200μL BCA工作液，37℃孵化30min。冷却后测量波长在563nm处的吸光度，绘制标准曲线，算得总蛋白浓度。

蛋白质免疫印迹（WB）：用RIPA裂解细胞外囊泡，4℃离心取上清液，BCS法测得蛋白浓度，调整至2μg/μL，加入5倍的上样缓冲液，100℃水浴10min。配制15%分离胶，5%浓缩胶，向每个梳孔中加2μL样品或者彩虹Marker；设置电压80V电泳至样品到达浓缩胶与分离胶界限，调电压至120V，电泳至溴酚蓝迁移到达分离胶底部；设置电流250mA，时间1h，转至PVDF膜。后将PVDF膜取出，用5%脱脂奶粉封闭1h；加入配制好的一抗，倒置孵育，4℃过夜；于摇床上TBST洗三次，每次10min；加入对应二抗，室温下倒置孵育1h；TBST，摇床洗三次，每次15min。A液与B液按1∶1配制发光液，避光孵育2min，凝胶成像仪成像。

实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）：取一定量细胞外囊泡，Trizol法提取总RNA，测得浓度。以100ng总RNA，10μL的反应体系行逆转录。用SYBR作为荧光指示行荧光定量检测，反应体系为：SYBR PREMIX EX TAQⅡ10μL，上下游引物各8μL，cDNA 2μL，RNAase Free ddH2O 6.4μL。每个实验样品设置3个重复样，每组实验重复1次。PCR循环设置为：95℃30s循环1次；95℃5s，60℃30s循环40次；95℃15s，60℃30s，95℃15s循环1次。分析熔解曲线与CT值，以2-ΔΔCt法计算特定基因相对表达量。

数据分析：使用GraphPad.Prism.v5.0软件制图与统计分析数据，非参数t检验比较差异，P＜0.05视为具有统计学意义。

结 果

1.唾液细胞外囊泡的提取与鉴定：通过超高速离心和外泌体分离提取，得到OSCC患者组和健康志愿者组的唾液细胞外囊泡。TEM检测结果示两组均表现为典型的囊泡形态，呈圆形，茶托样，直径大小在40～100nm（图1A）。蛋白免疫印迹实验显示常见的细胞外囊泡标志物CD63、CD81、CD9、Hsp 70在两组中均正常表达（图1B）。

图1 唾液细胞外囊泡的提取和鉴定

对提取的细胞外囊泡，用BCA蛋白定量法计算得出总蛋白浓度，可见患者组的蛋白浓度显著高于健康组（图2A）；而经trizol法提取的总RNA浓度，患者组和健康组并无明显差异（图2B）。

图2 唾液细胞外囊泡中总蛋白浓度和总RNA浓度

2.miRNA在唾液与血液源囊泡中的表达：从既往文献中查找到，miR-21可作为OSCC诊断标志物。本次实验中选择miR-21作为目标序列，对6例患者术前的唾液和血液提取总RNA后行RT-qPCR，进而得到miR-21的相对表达量（图3）。从柱状图中可见血液中miR-21的表达比唾液更高，而趋势则基本一致。为了确定血液与唾液中表达的相关性，将miR-21的相对表达量绘制成散点图，加入趋势线后计算得R2＝0.6951，相关系数ρ＝0.886，P＜0.05，趋向于正相关。

图3 唾液与血液细胞外囊泡miR-21-5p的相关性

3.miRNA辅助诊断OSCC：从既往文献中发现，miR-21、miR-10b-5p、miR-486-5p、miR-412-3p、miR-512-3p，可以作为OSCC的诊断标志。对患者组和健康组细胞外囊泡中5种miRNA的表达行RT-qPCR检测和分析，非参数t检验法比较差异。结果显示，miR-21-5p和miR-10b-5p在患者组表达高于对照组，而miR-512-3p、miR-412-3p、miR-486-5p的表现则无明显差异（图4）。

图4 患者组与健康组唾液细胞外囊泡中miR-21-5p、miR-10b-5p、miR-512-3p、miR-412-3p、miR-486-5p的相对表达量

为了评估miR-21-5p和miR-10b-5p在诊断中的准确性，根据各自RT-qPCR结果，在OSCC诊断中设置阈值，算得此时的灵敏度和1-特异度。进而得到受试者工作特征曲线（ROC）、曲线下面积（AUC）及置信区间（CI）（图5）。结果显示AUC（miR-21-5p）＝0.936，95% CI＝（0.849-1.023），P＝0.0001。AUC（miR-10b-5p）＝0.807，95%CI＝（0.646-0.967），P＝0.0069。两者AUC都大于0.5且接近1.0视为均具有较好的诊断意义。

图5 miR-21-5p和miR-10b-5p在诊断中的准确性

4.miRNA辅助OSCC患者术后判断：对7例患者收集术前及术后1月的唾液样本，提取细胞外囊泡，经RT-qPCR测 试miR-21-5p、miR-10b-5p、miR-486-5p、miR-412-3p、miR-512-3p的 表 达 变化，并以此绘制柱状图。结果显示后四种miRNA在术后3个月时未表现出规律的差异性（图6B～E）。而对于miR-21-5p，7例患者中的6例在1月后表现出表达的下降，1例变化不明显（图6A）。对第7例术后3月再次提取唾液，测得miR-21-5p的表达相对术前有显著的下降。因此，认为唾液细胞外囊泡中的miR-21-5p的表达，在OSCC术后疗效判断中具有一定的参考价值。

图6 患者手术前后唾液细胞外囊泡中miR-21-5p、miR-512-3p、miR-486-5p、miR-412-3p和miR-10b-5p的相对表达量

讨 论

miRNA是一类有内源性基因编码的、核苷酸链长大概20～24个的非编码类RNA，被证实与多种肿瘤的恶性发展、转移、抗药有关[2]。目前OSCC的病理辅助诊断方法有甲苯胺蓝染色法、组织活检法、荧光成像法、分子学检测法等[3～7]。在分子学检测中，Ki-67、p53、IV型胶原是报道较多的OSCC的生物标志物[8]。唾液中的主要成分有水，无机物，以及多种有机物，其中多种小分子具有辅助临床诊断的潜能，并且唾液相比血液或者组织取材更容易、安全。但是唾液中的分子具有多源性（口腔内为有菌环境），复杂性（唾液的分泌受多种调控），不稳定性（唾液中的酶使得蛋白质易降解）等问题。

既往研究表明，肿瘤组织会释放细胞外囊泡、循环肿瘤细胞及游离核酸进入体液循环[9]。其中细胞外囊泡的数量比循环肿瘤细胞更多且更易富集，膜的存在也使得相比游离核酸更稳定，因而近年来成为相关研究领域的一大热点[10]。因此提出一个设想，以细胞外囊泡为液体活检对象，检测细胞外囊泡来源的miRNA，可以显著降低实验复杂性和受干扰性，提高待测因子稳定性及检测结果可靠性。

本次实验对OSCC患者来源的唾液提取细胞外囊泡，进行TEM和WB检验，从形貌和表面标志物两个方向对细胞外囊泡作定性。在细胞外囊泡的总蛋白质与总RNA定量中，发现OSCC患者组总蛋白浓度相比健康对照组显著升高，而总RNA浓度则无明显差异，表明蛋白质表达过程中存在差异。为探究蛋白质表达水平发生变化的原因，对患者组和健康组唾液细胞外囊泡中的miR-21-5p、miR-10b-5p、miR-512-3p、miR-412-3p和miR-486-5p这 五 种miRNA进行RT-qPCR检验，结果显示在患者组miR-21-5p和miR-10b-5p的表达显著增高，这表明miR-21-5p和miR-10b-5p可以作为辅助诊断OSCC的标志物。相关研究表明，miR-21-5p通过拮抗PDCD4，PTEN等的活性，增强肿瘤的恶性行为，进而促进肿瘤发展；如果竞争抑制miR-21-5p的作用，则可相对抑制OSCC的发展[11～13]。对于miR-10b，多种肿瘤的报道认为其促进了上皮间质转化、诱导血管生成、抑制凋亡，促进肿瘤细胞增殖、迁移、抵抗免疫监视等，而当miR-10b表达被抑制时，肿瘤的转移也得以控制，预后更佳[14～16]。此处分别对比miRNA在患者组或健康组中的ROC，AUC后，认为miR-21-5p和miR-10b-5p在辅助诊断中具有很好的准确性。此外，也检测了唾液和血液中的细胞外囊泡，获得miR-21的相对表达趋势，结果显示两种来源的细胞外囊泡中，miR-21的表达近似正相关，这证实了唾液源细胞外囊泡作为诊断指标具有很好的可靠性。还采集了OSCC患者术前术后唾液行RT-qPCR检测，结果术后患者唾液中的miR-21的表达都表现出明显的下降。