果树组培生产中真菌污染的表现形式与预防

沈善超，周彩琴，王淑慧，赵文超，袁桂云，范志强

(1.诸城市万景源农业科技有限公司，山东诸城 262200；2.山东省林业保护和发展服务中心，山东济南 250014)

在果树组培生产过程中，污染是威胁实验室安全生产的关键因素，包括细菌性污染和真菌性污染。细菌性污染是可控的，在生产中可以带菌培养，在处理过程中有较长的缓冲时间。真菌性污染通常是致命的，没有任何的缓冲时间来处理，发现后只能通过高温高压灭菌处理。

真菌性污染在生产中有不同的表现形式，每种表现形式有不同的原因，采取的预防措施也不同。笔者根据多年的组培生产管理经验，提出了几种常见的真菌污染表现形式，分析了每种表现形式产生的原因，并提出预防方法，供组培从业人员参考。

1 培养基表面的点状真菌污染

1.1 表现形式

组培苗接种后，经过一段时间的培养，在培养基表面产生一个或数个真菌菌斑，菌斑很大，非常明显，主要集中在培养材料基部或周围(图1)，培养基其它地方也会有，但比例较少。这种污染是组培室生产过程中最为常见的污染。

1.2 原因和预防

这种少量点状真菌污染主要是由于选择母瓶不严格造成的，母瓶培养的材料本身已有真菌污染，在操作过程中发生交叉感染；二是操作不规范，工具消毒不彻底。

预防这种污染最重要的是安排专人严格挑选无真菌污染的培养材料。挑苗人员应经过严格的培训和长期的实践，能将普通人员看不到的污染苗挑出来，从而避免交叉感染。规范操作程序可以防止因为人员操作而造成的真菌污染。将已污染的材料挑出来，避免交叉污染。

图1 培养基出现点状菌斑

2 培养基表面的弥漫性真菌点状污染

2.1 表现形式

不同于培养基点状污染，弥漫性点状污染是指培养基表面产生大量的真菌菌斑，菌斑不大，但数量较多，比较均匀散布在培养表面的各个部位(图2)。这种污染一般出现在同一批次灭菌的培养基上，在培养基储存过程中就会出现污染。但也有批次培养基中个别培养基发现这种污染。

2.2 原因和预防

造成同一批次培养基弥漫性真菌点状污染的主要原因是培养基消毒不彻底，灭菌锅温度压力的传感系统出现问题，造成温度压力显示表的数值不正确。如果一个批次中个别培养基发生这种弥漫性污染，原因可能是瓶盖未拧紧，灭菌过程中因瓶内压力大冲开瓶盖，培养基冷却过快造成瓶内负压，空气被迅速压入培养基中，造成培养基表面弥漫式污染。

避免弥漫性真菌点状污染，在发现培养基产生这种弥漫性真菌污染后，要立即对灭菌锅进行检修，确保灭菌锅处于正常工作状态。同批次培养基个别产生这种污染后，要注意培养瓶盖要拧紧，同时灭菌后不要急于从灭菌锅中拿出培养基，待培养基冷却后再取出来。

图2 弥散性点状菌斑

3 培养瓶瓶壁瓶盖散布式少量点状真菌污染

3.1 表现形式

瓶壁和瓶盖处有少量的真菌菌斑，特别是近瓶口下面内凹处、瓶口和瓶盖螺旋口处及瓶盖内面通气口附近，特征是菌斑比较小，数量比较少，在瓶壁和瓶盖处分布不均匀(图3)。

3.2 原因和预防

造成这种污染的主要原因是培养瓶没有及时洗刷和充分浸泡，造成干涸的微小培养基颗粒存在于培养瓶的死角处。这种干涸的微小培养基颗粒内部可能包含真菌孢子，在正常的灭菌程序中灭菌不彻底，条件适宜时孢子萌发造成真菌污染。

避免此种污染，要确保培养瓶洗刷前充分浸泡，在洗刷过程中特别注意近瓶口下面内凹处、瓶口和瓶盖螺旋口处及瓶盖内面通气口附近等死角处，保证培养瓶洗刷干净。

图3 瓶壁瓶盖螺纹处点状真菌

4 培养瓶瓶壁网状菌丝真菌污染

4.1 表现形式

主要表现在瓶壁上附着有白色网状菌丝，菌丝面积大小不一，数量不一，分布比较均匀，薄薄的一层，颜色很浅，不易被发现(图4)。

图4 瓶壁网状菌丝真菌

4.2 原因和预防

造成这种方式污染的主要原因是瓶壁上有残留培养基。当培养瓶使用年限过长，瓶盖螺旋口可能会出现磨损，瓶盖上的透气膜也会发生破裂，造成培养瓶封闭性变差而造成的。这种污染在生产中的危害程度最大，一般不易观察到，经接种后造成交叉污染。定期更换培养瓶，特别是更换培养瓶盖可有效解决。