气-液微萃取技术(GLME)处理食品香精香料特定物质操作条件的优化

牟莉，康琴，贺小峰，叶琳洋，李刚

(1.长春大学 食品科学与工程学院，长春 130022；2.吉林省食品检验所，长春 130023)

食品香精香料主要是改善、增加和模仿食品香气和香味的食品添加剂，并具有组成复杂、易挥发、不稳定等特点[1-4]。在分析食品香精香料成分的过程中，恰当的前处理方法对研究结果会起到关键作用。目前在挥发性物质的提取方法中应用较为广泛的有水蒸气蒸馏法、蒸馏萃取法、静态顶空法、减压蒸馏法、超临界CO2萃取法、固相微萃取法等[5-9]，每种提取方法都有着自身优势和不足。气-液微萃取技术(GLME)作为一种较新颖的便携式前处理方法，目前还未有相关报道将气-液微萃取技术(GLME)应用在食品的香精香料检测的前处理技术中。利用气-液微萃取技术(GLME)在限定的温度范围内将样品中的挥发性成分几乎完全地吹扫捕集出来的特点[10-12]，将其应用于分析食品中常用的香精香料(乙基麦芽酚、香叶醇、香豆素、丁香酚、八角茴香油)的研究。因此，在气-液微萃取技术(GLME)的优化过程中，考察提取温度、提取时间、冷凝温度和气体流速这4项因素，并通过单因素实验与响应面优化相结合的方法具体实现气-液微萃取技术GLME应用于食品中常用香精香料成分的研究中。

1 材料与方法

1.1 实验材料

超纯水；二氯甲烷(色谱纯，纯度95%，TEDIA)；甲醇(色谱纯，纯度95%，TEDIA)；乙基麦芽酚(纯度99%，百灵威)；香叶醇(纯度98%，百灵威)；八角茴香油、香豆素(纯度98%，百灵威)；丁香酚(纯度98%，百灵威)；无水硫酸钠(分析纯，使用前在400 ℃条件下灼烧12 h，贮于干燥器中，冷却后备用)：国药集团化学试剂有限公司；石英玻璃棉(使用前400 ℃活化10 h)：奥瑞斯新材料科技有限公司。

1.2 实验仪器

ME-101气-液微萃取仪 延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室研制开发；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津(SHIMADZU)公司；移液枪。

1.3 标准工作溶液的配制

标准混合储备液：精确称取5种标准品各0.1000 g置于同一个100 mL的棕色容量瓶中，利用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1000.0 mg/L的混合标准溶液，贮藏备用。

标准混合溶液使用液：分别精确移取储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容，依次配制成20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg/mL的标准混合使用液。

2 气-液微萃取技术(GLME)操作条件优化

气-液萃取仪的工作原理：通过恒定流速的惰性气体(N2)将置于设定温度下加热槽内样品中的挥发性目标化合物吹扫至带有可以调节温度的冷凝器的样品池内进行捕集，再经过仪器的精确定容，即完成整个前处理过程。整个过程可以一体化完成对目标化合物的定量提取，并具有耗时短、操作简便、节约成本和便于现场操作等优势。

加标样品溶液的配制：向100 mL的棕色容量瓶中移取10.0 mL的标准混合储备液，用超纯水定容至刻度，备用。

2.1 气-液微萃取技术(GLME)操作条件的单因素实验

2.1.1 提取温度对食品香精香料回收率的影响

设定气-液微萃取技术(GLME)的操作条件：提取时间4 min、冷凝温度-4 ℃、气体流速2.0 mL/min。提取温度分别为240，250，260，270，280，290，300 ℃，考察不同提取温度对样品加标回收率的影响，结果见图1。

图1 不同提取温度下样品的加标回收率结果Fig.1 The recovery rates of of samples at different extraction temperatures

由图1可知，当提取温度在240～270 ℃梯度内，5种标准品中除香豆素外样品的加标回收率均呈上升趋势；当提取温度在280～300 ℃梯度内，5种标准品的加标回收率都呈现出下降的趋势。这种温度升高而加标回收率降低的现象产生与标准品的结构发生改变相关，在温度不断升高的同时可能发生了裂解反应或是形成了同分异构体，因此本文中提取温度的最佳值应该在270 ℃左右。

2.1.2 提取时间对食品香精香料回收率的影响

设定气-液微萃取技术(GLME)的操作条件：提取温度270 ℃、冷凝温度-4 ℃、气体流速2.0 mL/min，提取时间分别设为4，5，6，7，8 min。最后经GC-MS解析，考察不同提取时间对样品加标回收率的影响，结果见图2。

图2 不同提取时间下样品的加标回收率结果Fig.2 The recovery rates of of samples at different extraction time

由图2可知，提取时间在4～7 min阶段中，5种标准品的加标回收率均呈缓慢上升趋势；7 min后，样品的加标回收率的变化基本趋于平缓，说明当提取时间作为单一变量条件时，在提取时间达到某一临界值后，过多的提取时间并不会对实验造成很大的影响，并且过长的提取时间反而会浪费实验时间，即提取时间达到饱和值后，持续增加提取时间会降低气-液微萃取技术(GLME)的工作效率，因此最适提取时间选取7 min。

2.1.3 冷凝温度对香精香料回收率的影响

设定气-液微萃取技术(GLME)的操作条件：提取温度270 ℃、气体流速2.0 mL/min、提取时间7 min，冷凝温度分别设为-5，-4，-3，-2，-1，0 ℃，考察不同冷凝温度对样品的加标回收率的影响，结果见图3。

图3 不同冷凝温度下样品的加标回收率结果Fig.3 The recovery rates of of samples at different condensation temperatures

由图3可知，冷凝温度对于气-液微萃取技术(GLME)的提取影响较为显著，当冷凝温度从-5 ℃升高至-2 ℃的过程中，样品的加标回收率增加趋势明显，当冷凝温度处于-2 ℃时，5种标准品的回收率均处于实验结果中的最高值；当冷凝温度继续升高后，回收率开始明显降低，说明冷凝温度需要达到一定程度时，才可以较好地完成气相向液相的转变，使得通过GLME提取的挥发性物质可以尽可能地接收回来，因而选取-2 ℃为最佳冷凝温度。

2.1.4 气体流速对食品香精香料加标回收率的影响

设定气-液微萃取技术(GLME)的操作条件：提取温度270 ℃、冷凝温度-4 ℃、提取时间7 min，气体流速分别设为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min，考察不同气体流速对样品加标回收率的影响，结果见图4。

图4 不同气体流速下样品的加标回收率结果Fig.4 The recovery rates of of samples at different gas flow rates

由图4可知，提取过程中当气体流速在1.0～2.5 mL/min的梯度范围内，样品的加标回收率显著提高，当气体流速在2.5 mL/min时，样品的加标回收率处于峰值；而继续提高气体流速后回收率明显下降，证明过快的气体流速虽然在理论上可以增大一定的接触面积，但是在密闭环境下过快的气体流速使得吹扫状态变得不稳定，使样品中的挥发性成分无法稳定地被吹扫捕集，因而以2.5 mL/min作为气-液微萃取技术(GLME)操作过程中最适宜的气体流速。

2.2 响应面设计优化

采取3水平Box-Behnken的响应面设计优化气-液微萃取技术(GLME)对提取5种食品香精香料中挥发性成分的操作条件(提取温度A、提取时间B、气体流速C、冷凝温度D这4个因素)，以样品的加标回收率作为响应变量，利用Design Expert 11.1.0.1软件设计实验并处理实验数据，从而可以得到最适宜的气-液微萃取技术(GLME)对提取香精香料中挥发性成分的操作条件。

表1 响应面实验数据及其响应值Table 1 Response surface experimental data and response values

表2 响应面实验数据Table 2 Response surface experimental data

续 表

3 结果与讨论

3.1 响应面模型拟合

利用Design Expert 11.1.0.1软件设计实验并处理实验数据，得到4个因素与样品加标回收率的二元多次回归方程公式：

Y1=2.007A+9.137B+9.458C+0.667D-0.006AB+0.002AC-0.009AD+0.008BC-0.024BD+0.024CD-0.004A2-0.537B2-1.990C2-0.500D2-233.670。

(1)

Y2=2.004A+8.964B+10.120C+1.218D-0.006AB-0.001AC-0.010AD+0.008BC-0.055BD+0.024CD-0.004A2-0.529B2-1.999C2-0.489D2-214.024。

(2)

Y3=1.946A+9.468B+10.507C+0.891D-0.006AB-0.001AC-0.010AD-0.043BC-0.021BD+0.024CD-0.004A2-0.550B2-2.010C2-0.497D2-226.807。

(3)

Y4=1.979A+9.210B+10.046C+0.907D-0.006AB-0.001AC-0.010AD+0.008BC-0.024BD+0.024CD-0.004A2-0.541B2-1.985C2-0.500D2-209.803。

(4)

Y5=6.109A+27.082B+48.853C+5.221D-0.016AB-0.081AC-0.030AD+1.414BC-0.256BD-0.649CD-0.011A2-1.905B2-7.640C2-1.673D2-873.601。

(5)

其中，A为GLME操作条件中的提取温度；B为GLME操作条件中的提取时间；C为GLME操作条件中的气体流速；D为GLME操作条件中的冷凝温度。由上述公式可知，A、B、C、D、AC、BC、CD对加标样品的回收率起协同作用。

3.2 响应面的方差分析

在表3中，p值<0.05的交互因素有AD；在表4中，p值<0.05的交互因素有AB、AD；在表5中，p值<0.05的交互因素有AB、AD；在表6中，p值<0.05的交互因素有AB、AD；在表7中，p值<0.05的交互因素有BC；各响应值的校正R2与实际R2结果表见表8。

表3 响应面对加标样品中乙基麦芽酚回收率的二次模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface regression model of ethyl maltol recovery rate in samples

表4 响应面对加标样品中香叶醇回收率的二次模型方差分析表Table 4 ANOVA for response surface regression model of geraniol recovery rate in samples

表5 响应面对加标样品中八角茴香油回收率的二次模型方差分析表Table 5 ANOVA for response surface regression model ofstar anise oil recovery rate in samples

表6 响应面对加标样品中丁香酚回收率的二次模型方差分析表Table 6 ANOVA for response surface regression model of eugenol recovery rate in samples

表7 响应面对加标样品中香豆素回收率的二次模型方差分析表Table 7 ANOVA for response surface regression model ofcoumarin recovery rate in samples

表8 各响应值的校正R2与实际R2结果Table 8 The corrected R2 and actual R2 results for each response

由表8可知，各响应值的校正R2与实际R2之间的差值除样品中香豆素的回收率外，其余均小于0.1；样品中香豆素的回收率的校正R2与实际R2的差值为0.1603，<0.2；因而，可以证明响应面模拟的模型可信度较高，所预测的气-液微萃取技术(GLME)操作条件的各参数准确性更可靠。

3.3 两两因素交互响应面结果

为了将响应面拟合的模型更直观地展示，将通过气-液微萃取技术(GLME)各操作参数因素(A提取温度、B提取时间、C气体流速和D冷凝温度)两两交互作用影响对加入混标的样品中不同标准品的回收率(响应值)之间所拟合的响应面见图5～图9。

图5 样品中乙基麦芽酚的回收率因素AB交互响应面和等高线Fig.5 The response surface and contour line of AB interaction on recovery rate of ethyl maltol in the sample

图6 样品中香叶醇的回收率因素AB交互响应面示意图Fig.6 The response surface and contour line of AB interactionon recovery rate of geraniol in the sample

图7 样品中八角茴香油的回收率因素AD交互响应面示意图

图8 样品中丁香酚的回收率因素AD交互响应面示意图

图9 样品中香豆素的回收率因素BC交互响应面示意图Fig.9 The response surface and contour line of BC interaction for recovery rate of coumarin in the sample

当两个因素之间交互作用越强，对响应值的影响越显著，所拟合出的响应面越弯曲陡峭，等高线越密集，形状越趋于椭圆化；反之亦然。由表3～表7中的F值和p值也可以相互佐证。

3.4 最优化设计

根据响应面模拟优化出的最佳操作参数结果见表8，根据气-液微萃取技术(GLME)实际操作条件的限制，需要在优化结果的基础上做出一定的微调，最终得到的最佳条件和各响应值的结果见表9和表10。

表9 气-液微萃取技术(GLME)各操作参数的优化条件和实际条件Table 9 The optimized condition and actual condition for GLME operating parameters

表10 气-液微萃取技术(GLME)在优化条件与实际条件下提取各响应值结果Table 10 The response value results of GLME under optimized condition and actual condition

4 结论

建立了一种气-液微萃取技术(GLME)在食品香精香料中的应用，以食品香精香料中常见的易挥发的特定5种物质(乙基麦芽酚、香叶醇、八角茴香油、丁香酚、香豆素)进行测定，对影响操作的4个因素(提取温度、提取时间、冷凝温度、气体流速)进行单因素和响应面分析，利用Box-Behnken的响应面设计建立四因素三水平的响应面优化实验，通过Design Expert 11.1.0.1软件，优化并根据实际情况得到最佳的气-液微萃取技术(GLME)操作条件，提取温度268 ℃、提取时间7 min、冷凝温度-2 ℃和气体流速2.5 mL/min，经验证，乙基麦芽酚回收率为78.901%，香叶醇回收率为97.903%，八角茴香油回收率为79.899%，丁香酚回收率为99.904%，香豆素回收率为96.736%，各响应值的结果均体现了较高的得率，为以后食品中常见香精香料成分的研究提供了理论基础。