柠檬酸铜对肉兔生长性能、小肠黏膜发育和血清生化指标的影响

郭志强 胡海强 谢晓红 邝良德 李丛艳 雷 岷 郑 洁 杨 锐 李明晖*

(1.四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川重点实验室，成都 610066；2.西南大学动物科学技术学院，重庆 400715)

铜是动物生长发育不可缺少的微量元素之一，具有促进动物生长，参与机体造血，影响免疫器官发育、免疫和抗氧化功能发挥等多种功能。大量研究表明，在动物实际生产中添加高剂量的铜可以获得明显的促生长效果，但过量的铜进入体内不易被动物体吸收，会随粪便排出体外，污染环境，并且铜还会在动物组织中沉积，在人类食用后影响身体健康[1-2]。而柠檬酸铜与硫酸铜相比具有生物学效价高、易被动物机体吸收、利用率高等优势，并能有效地减少铜的排放量和残留量，保护生态环境[3]。李凡等[4]研究显示，饲粮中添加60 mg/kg硫酸铜能够显著提高生长獭兔的平均日增重和平均日采食量。Peng等[5]研究发现，30～60 mg/kg柠檬酸铜可以显著提高仔猪的生长性能，降低铜在体内的残留，提高仔猪抗氧化功能，降低盲肠大肠杆菌数量，增加乳酸杆菌数量。Yan等[6]研究发现，饲粮中添加20 mg/kg柠檬酸铜组仔猪的平均日增重、平均日采食量和料重比与饲粮中添加180 mg/kg硫酸铜组无显著差异，但是柠檬酸铜可以提高仔猪骨髓抗菌肽的表达量，显著降低仔猪腹泻率。柠檬酸铜是我国农业农村部2019年批准的新型饲料添加剂，目前关于饲粮中添加柠檬酸铜的研究主要集中在仔猪上，而关于柠檬酸铜在肉兔饲粮中的应用研究鲜见报道。因此，本试验以新西兰兔为研究对象，研究饲粮中添加柠檬酸铜对其生长性能、小肠黏膜发育和血清生化指标的影响，比较硫酸铜和柠檬酸铜的作用效果，为柠檬酸铜在肉兔饲粮中的科学应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

柠檬酸铜，市售，铜含量在34.5%～36.7%；硫酸铜，市售，铜含量≥25.1%。

1.2 试验设计

选择28日龄断奶、体重相近的新西兰肉兔420只，随机分为5组，每组14个重复，每个重复6只(公母各占1/2)。5组肉兔分别饲喂在基础饲粮中添加0(对照组)、10、20 mg/kg(以铜计)柠檬酸铜以及20、150 mg/kg(以铜计)硫酸铜的试验饲粮，各组饲粮实测铜含量依次为4.6、15.1、24.6、24.7和148.4 mg/kg。预试期7 d，正试期42 d。

1.3 基础饲粮与饲养管理

基础饲粮配方参照谷子林等[7]推荐的营养水平和结合本地饲料资源设计，制成颗粒饲料(颗粒直径3 mm，长度6～8 mm)。基础饲粮组成及营养水平见表1。试验前对兔舍进行彻底冲洗和严格消毒，试验期间饲养管理和免疫程序采用常规方法，自由采食、自由饮水。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.4 样品采集

在正试期结束当天，选择体重与该组平均体重接近的6只兔(公母各占1/2)，经耳缘动脉采血5 mL，采血后静置10 min，待血液凝固后，经3 000 r/min离心20 min，然后分离血清并分装于1.5 mL的EP管中，放置在-80 ℃冰箱中冷冻保存，用于血清生化指标的检测。将采完血的肉兔进行屠宰，取十二指肠、空肠和回肠中段3 cm长的组织样品，用生理盐水冲洗干净并迅速固定于10%福尔马林缓冲液中24 h，用于测定小肠黏膜发育指标。

1.5 测定指标和方法

1.5.1 生长性能

于正试期开始和结束当天晨饲前空腹称重，计算净增重、平均日增重；准确记录试验兔的喂料量和余料量，计算平均日采食量；根据试验兔的平均日采食量和平均日增重，计算料重比；记录试验期间发生过腹泻的兔的只数和死亡兔只数，计算腹泻率和死亡率。

腹泻率(%)=(腹泻兔只数/试验兔总只数)×100；
死亡率(%)=(死亡兔只数/试验兔总只数)×100。

1.5.2 小肠黏膜发育指标

固定的组织样品经洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋等处理后切片(5 μm)，将切片置于载玻片上，苏木精-伊红染色，封片。选择完整且走向良好的绒毛测量绒毛高度和隐窝深度，绒毛高度是从绒毛顶端到绒毛隐窝交界处的距离，隐窝深度定义为相邻绒毛间的内陷深度。用Nikon Eclipse TS100显微镜和NIS-ELEMENT F3.2成像软件对切片进行组织学观察并拍照。使用Imageproplus 5.1图像分析软件分析每个样品的绒毛高度和隐窝深度，每个样品测量10次，获得每个指标的平均值，用于统计分析。

1.5.3 血清生化指标

血清胰岛素(Ins)、生长激素(GH)、类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量和铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、铜蓝蛋白(CP)活性均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测，根据说明书要求进行操作。

1.6 数据处理与分析

试验数据用Excel 2016进行简单处理后，采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和卡方分析，并采用Duncan氏法多重比较检验组间差异显著性，结果表示为“平均值±标准差”，以P<0.05为差异显著，以P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸铜对肉兔生长性能的影响

由表2可知，饲粮中添加柠檬酸铜和硫酸铜均可提高肉兔的生长性能、降低腹泻率和死亡率。其中，20 mg/kg柠檬酸铜组和150 mg/kg硫酸铜组的平均日增重显著高于对照组(P<0.05)，料重比、死亡率和腹泻率显著低于对照组(P<0.05)，且20 mg/kg柠檬酸铜组和150 mg/kg硫酸铜组之间各生长性能指标均无显著差异(P>0.05)。

表2 柠檬酸铜对肉兔生长性能的影响

2.2 柠檬酸铜对肉兔小肠黏膜发育的影响

由表3可知，饲粮中添加柠檬酸铜和硫酸铜均可以提高肉兔小肠各段绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度，且随着铜添加量的增加绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度呈提高趋势。其中，20 mg/kg柠檬酸铜组和150 mg/kg硫酸铜组肉兔小肠各段绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度均显著高于对照组(P<0.05)，但20 mg/kg柠檬酸铜组和150 mg/kg硫酸铜组之间上述指标无显著差异(P>0.05)。饲粮中添加柠檬酸铜和硫酸铜均有降低肉兔小肠各段隐窝深度的趋势，随着铜添加量的增加降低趋势更明显，其中以150 mg/kg硫酸铜组小肠各段隐窝深度最小，但各组之间差异均不显著(P>0.05)。

表3 柠檬酸铜对肉兔小肠黏膜发育的影响

2.3 柠檬酸铜对肉兔血清生化指标的影响

由表4可知，饲粮中添加柠檬酸铜和硫酸铜对肉兔血清中胰岛素样生长因子-Ⅰ含量均无显著影响(P>0.05)，但可显著提高血清中铜超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白活性和胰岛素、生长激素含量(P<0.05)，并均以150 mg/kg硫酸铜组最高，但其血清中铜超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白活性和生长激素含量与20 mg/kg柠檬酸铜组差异不显著(P>0.05)。

表4 柠檬酸铜对肉兔血清生化指标的影响

3 讨 论

3.1 柠檬酸铜对肉兔生长性能的影响

众多研究表明，有机铜、螯合铜等有机铜源在饲粮中的添加效果显著优于无机铜源硫酸铜[3,8-10]。本试验结果表明，20 mg/kg柠檬酸铜组和150 mg/kg硫酸铜组在平均日采食量、平均日增重和料重比上均差异不显著，且20 mg/kg柠檬酸铜组的料重比更低，低剂量柠檬酸铜和高剂量硫酸铜在促进肉兔生长方面的效果相当，这可能与柠檬酸铜吸收利用率较高[8]有关。晏家友等[8]研究了饲粮中添加20 mg/kg不同铜源的铜对肉兔生产性能的影响，研究结果显示柠檬酸铜组的平均日增重和料重比显著优于同剂量硫酸铜组，与本试验结果一致。研究发现，铜在抵抗外来病原、增加机体免疫力、提高采食量和生产性能等方面发挥重要作用[3]。本试验中20 mg/kg柠檬酸铜组肉兔腹泻率和死亡率显著降低，其可能原因：1)众多研究表明，高铜可以降低腹泻，本试验中柠檬酸铜的吸收率显著高于硫酸铜，20 mg/kg柠檬酸铜在体内本吸收的铜量相当于150 mg/kg硫酸铜，在机体内可能发挥了高铜作用[1]；2)柠檬酸铜在体内分解出柠檬酸，研究发现柠檬酸可以酸化肠道，降低腹泻[11]；3)研究发现柠檬酸铜可以显著降低盲肠大肠杆菌书量，提高乳酸杆菌数量[5]，而大肠杆菌是肉兔腹泻的最重要致病菌，乳酸菌是肉兔盲肠最重要的有益菌；4)还可能与血清溶菌酶含量提高相关，Yan等[6]研究发现饲粮添加柠檬酸铜可提高断奶仔猪血清溶菌酶含量。

3.2 柠檬酸铜对肉兔小肠黏膜发育的影响

研究表明，断奶后饲粮中的铜是保证动物肠道发育和生长的必要条件之一，高铜具有改善肠道微观形态等方面的作用[9-10,12]。本试验结果显示，饲粮中添加20 mg/kg柠檬酸铜可以显著提高肉兔小肠各段绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度，且20 mg/kg柠檬酸铜组与150 mg/kg硫酸铜组无显著差异，这表明在饲粮中添加20 mg/kg柠檬酸铜可以有效增大肠道吸收面积，提高营养物质的吸收利用率，且与高剂量硫酸铜效果相当。低剂量柠檬酸铜能够提高小肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度，可能与柠檬酸铜的铜生物利用率较高和柠檬酸所起到的酸化剂作用高度相关，研究发现柠檬酸具有提高肠道黏膜发育的作用[11,13]。尽管饲粮中添加柠檬酸铜对小肠各段隐窝深度无显著影响，但随着饲粮中柠檬酸铜添加量的增加小肠各段隐窝深度变浅趋势更加明显。

3.3 柠檬酸铜对肉兔血清生化指标的影响

动物体内存在多种含铜酶，铜超氧化物歧化酶和铜蓝蛋白是体内重要的含铜酶，体内铜含量变化可导致含铜酶活性的变化[14]。Hawk等[15]报道，动物体内如果出现铜缺乏，则会导致超氧化物歧化酶活性降低，引起机体组织损伤。王艳华[16]研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加240 mg/kg的硫酸铜可以显著提高肝脏中超氧化物歧化酶活性。本试验中20 mg/kg柠檬酸铜与150 mg/kg硫酸铜有相同的提高铜超氧化物歧化酶和铜蓝蛋白活性的作用，可能与柠檬酸的酸化作用有关，具体作用机制有待进一步研究。胰岛素、生长激素和胰岛素样生长因子-Ⅰ含量在一定范围内升高时，可加速葡萄糖的利用，促进蛋白质合成，提高营养代谢和生长发育速度。吴金节等[17]研究发现，高铜可以显著提高断奶仔猪血清中生长激素和胰岛素含量。马德磊[12]的试验结果表明80和160 mg/kg铜可以显著提高生长肉兔血清中胰岛素和生长激素含量，但对血清中胰岛素样生长因子-Ⅰ含量无显著影响，上述试验结果与本试验结果类似，饲粮中添加20 mg/kg柠檬酸铜可显著提高肉兔血清中胰岛素和生长激素含量，低剂量的柠檬酸铜与高剂量的硫酸铜作用效果相似，这可能与柠檬酸可以增加胰高血糖素样2和葡萄糖转运蛋白mRNA表达相关。

4 结 论

本试验条件下，饲粮中添加20 mg/kg柠檬酸铜可以显著提高肉兔的生长速度，降低腹泻率和死亡率，增强肠道发育，提高血清含铜酶活性和生长激素、胰岛素含量，其作用效果与150 mg/kg硫酸铜相当。