乙烯利过度刺激诱发橡胶树死皮的生理效应*

刘 辉 胡义钰 冯成天 袁 坤 王真辉

(中国热带农业科学院橡胶研究所 省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室 农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室 海口 571101)

天然橡胶是不可或缺的工业原料和重要战略物资，主要源于橡胶树(Heveabrasiliensis)，生产中普遍采用乙烯利(一种乙烯释放剂)刺激割胶技术。乙烯利刺激增产效果显著，但过度刺激会增加橡胶树死皮(tapping panel dryness，TPD，亦称割面干涸或死皮病)发生(袁红梅等，2013；位明明等，2016；Montoroetal.,2018)。橡胶树死皮是复杂的生理综合症，主要由强割和强乙烯利刺激等导致，表现为割线局部或全部不排胶(Chenetal.,2003；覃宝祥等，2005；Putrantoetal.,2015)。目前，橡胶园的死皮率普遍在20%以上，由其导致的年产量损失达15%～20%(de Fa,2011)。橡胶树死皮防治已成为天然橡胶产业持续健康发展亟待解决的难题。乙烯利过度刺激是诱发橡胶树死皮的主要原因之一，因此研究死皮机制是采取有效防治措施的基础。

胶乳的pH值、干胶含量、黄色体破裂指数、无机磷含量、硫醇含量等生理参数能在一定程度上反映橡胶树乳管系统的代谢和健康状况(肖再云等，2009)。同健康橡胶树的胶乳相比，死皮橡胶树胶乳的黄色体破裂指数和干胶含量升高(杨少琼等，1989；郭秀丽等，2016)，pH值、硫醇和无机磷含量降低(庄伯强，1986；杨少琼等，1898；Putrantoetal.,2015；郭秀丽等，2016)。此外，Putranto等(2015)还发现，死皮橡胶树胶乳的蔗糖含量比健康树低。但郭秀丽等(2016)研究表明胶乳的蔗糖含量随死皮程度提高而逐渐升高。在上述研究中，所用的死皮橡胶树均为胶园自然死皮植株，死皮诱因并不清楚，可能未能真实反映乙烯利刺激诱导橡胶树死皮发生的生理效应。

为针对性地探究乙烯利过度刺激诱发橡胶树死皮的生理机制，何晶等(2018)选取健康橡胶树进行高浓度乙烯利刺激采胶，逐步诱导死皮发生发展，并测定分析死皮发展过程中胶乳生理参数变化。同健康橡胶树相比，乙烯利刺激诱发的轻微死皮植株胶乳黄色体破裂指数升高、pH值降低，这与上述其他研究结果基本吻合。但研究也发现在乙烯利刺激诱发的轻微死皮植株中，胶乳干胶含量下降、硫醇和无机磷含量升高，这与上述他人研究结果相反。乙烯利过度刺激采胶诱导橡胶树死皮发生发展过程中，症状由割线全线正常排胶逐步转变为内缩、严重内缩、死皮(何晶等，2018)。死皮长度不断增加，呈现出1～5级的死皮等级(王真辉等，2014)。前期研究多是针对早期阶段，即由健康至刚出现轻微死皮(1级左右)。本研究在前期研究的基础上，进一步分析了死皮发展后期的胶乳相关生理生化指标变化特性，以期进一步揭示乙烯利过度刺激采胶诱发橡胶树死皮的生理机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用的橡胶树品种‘热研7-33-97’植株来自海南省儋州市中国热带农业科学院试验场六队9号林段，地理位置为109°49′E、19°47′N。这些植株均是2003年定植，2011年开割，采用的是s/2 d/3割制(割线长度为树围的二分之一，每3天割1刀)。选择离地面1 m处的树围在61～71 cm、树体健康的植株，转换割面，采用s/2 d/3割制进行割胶。在割第4～6刀时跟踪观测割线症状，从中选择割线排胶完全正常的植株60株。其中，48株为高浓度乙烯利处理组(ET组)，12株为对照组(CK组)。

1.2 试验方法

1.2.1 高浓度乙烯利处理及死皮观测 2019年5—9月，对ET组进行乙烯利过度刺激采胶。不同浓度的乙烯利溶液采用乙烯利原药(北京索莱宝科技有限公司)配制。处理时，用毛刷将乙烯利溶液均匀涂刷在割线及其上下各2 cm的割面上，每次每株树涂约5 mL，每10天左右涂1次，具体涂施日期与浓度见表1。CK组不进行乙烯利处理。处理过程中，ET组和CK组均采用s/2 d/3割制割胶。每次割胶后，测量各植株胶乳产量。最后一次乙烯利处理后第3刀割胶时，观测各植株死皮长度和割线长度，参照橡胶树死皮分级标准确定死皮等级(王真辉等，2014)。0级：死皮长度 =0；1级：0 <死皮长度 ≤ 2 cm；2级：2 cm <死皮长度 ≤ 割线长度的1/4；3级：割线长度的1/4 <死皮长度 ≤ 割线长度的1/2；4级：割线长度的1/2 <死皮长度 ≤ 割线长度的3/4；5级：死皮长度 >割线长度的3/4。根据观测结果，采集健康和2～5级死皮植株的胶乳，用于测定相关生理生化指标。

表1 ET组乙烯利涂施日期和浓度Tab.1 Ethephon application date and concentration in ET group

1.2.2 胶乳相关生理生化指标的测定 在割胶胶乳停排后，采用量筒测量每株橡胶树收集的胶乳产量；取胶乳样品10 mL，测定pH值，参照郭秀丽等(2016)的方法测定干胶含量，参照龙翔宇等(2014)的方法测定胶乳总固形物含量，参照程成等(2012)的方法测定胶乳黄色体破裂指数，参照杨少琼等(1989)的方法测定胶乳硫醇含量，采用钼酸铵比色法测定胶乳无机磷含量，具体方法参照Taussky等(1953)。

1.2.3 胶乳橡胶粒子粒径分布及平均粒径的测定取新鲜胶乳0.5 mL于2 mL离心管中，加入0.5 mL缓冲液(72.87 g·L-1甘露醇、8 g·L-1氯化钠、0.20 g·L-1氯化钾、0.24 g·L-1磷酸二氢钾、1.15 g·L-1磷酸二氢钠，pH7.4)，混匀后置于冰上带回实验室。向各样品离心管中再加入1 mL缓冲液，混匀后，4 ℃ 8 000 r·min-1离心10 min，将上部成分转入新的离心管，混匀。取200 μL样品溶液，用激光散射粒度分布分析仪(LA-960S，日本HORIBA公司)测定橡胶粒子粒径大小分布和平均粒径。在测量条件中，相对折射率文件选择natural rubber2，注释选择latex 1.388，粒径基准选择体积。具体参数设定：透过率T%范围标记中设定透光率(laser)上限为90%，下限为80%；设定透光率(lamp)上限为90%，下限为70%。透光率(laser)和透光率(lamp)分别指激光和LED光源下的透光率。在加液器设定中，注入量选择中水位。在计算设定中，胶乳橡胶粒子折射率参数为1.388，分散剂为水，其折射率为1.333。

1.2.4 数据处理 数据统计分析采用SPSS18.0 软件，数据图表制作采用Excel 2007软件。

2 结果与分析

2.1 乙烯利过度刺激诱发死皮过程中的胶乳产量变化

对乙烯利过度刺激采胶4个月左右的样树，进行了死皮症状观测。发现ET组48株中有45株表现出不同程度的死皮，死皮率高达93.75%。其中，1级死皮4株，2级14株，3级13株，4级8株，5级6株(表2)。CK组12株橡胶树均无死皮症状，这表明是乙烯利过度刺激采胶快速诱发了橡胶树死皮。

表2 乙烯利过度刺激后橡胶树植株死皮发生情况Tab.2 The occurrence of tapping panel dryness (TPD)of rubber trees after ethephon overstimulation

为明确高浓度乙烯利刺激对胶乳产量的影响，跟踪观测了各植株每割次的胶乳产量。在比较健康(0级)与2～5级死皮橡胶树的平均单株胶乳产量变化趋势后发现，CK组随割次增加逐渐升高，在后期阶段逐渐趋于平稳；ET组2～5级死皮样树均呈先升后降的趋势(图1)。在第26割次之前，高浓度乙烯利刺激极大提升了单株胶乳产量。同CK组相比，ET组各级植株平均单株胶乳产量普遍增加3倍以上。第26割次之后，ET组各死皮等级样树的产量仍明显高于CK组，但乙烯利过度刺激的负面效应逐步显现，包括死皮发生，平均单株胶乳产量逐步下降。死皮等级越高，死皮出现越早，单株胶乳产量开始下降越早，产量下降也越迅速。第37割次时，2级死皮植株的平均单株胶乳产量仍明显高于CK组，3级死皮植株与CK组接近，均为95 mL左右，而4和5级死皮植株的平均单株胶乳产量仅为39 mL和15 mL，明显低于CK组(图1)。

图1 乙烯利过度刺激采胶过程中各级死皮橡胶树的胶乳产量变化Fig.1 Changes of latex yield of rubber trees with different grades of tapping panel dryness (TPD)during tapping with ethephon overstimulation

2.2 不同死皮等级橡胶树的胶乳干胶和总固形物含量变化

由图2A和2B可知，不同死皮等级样树的胶乳干胶含量和总固形物含量变化趋势基本一致。与CK组健康(0级)植株的胶乳干胶和总固形物含量(33.2%和40.9% )相比，2～3级死皮植株表现为逐步降低，而4～5级死皮植株开始逐渐回升，但2～4级死皮植株的含量均显著低于健康植株，其中3级死皮植株的含量最低(分别低6.5%和7.5%)，5级死皮植株则基本回归到健康植株水平。

图2 不同死皮等级橡胶树的胶乳干胶(A)和总固形物(B)含量差异Fig.2 Differences in dry rubber (A)and total solid (B)contents of latex from rubber trees with different grades of tapping panel dryness (TPD)不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same below.

2.3 不同死皮等级橡胶树的胶乳pH值和黄色体破裂指数变化

同健康(0级)植株相比，乙烯利过度刺激诱发的2～5级死皮橡胶树的胶乳pH值略有上升(图3A)。其中，3级死皮植株胶乳pH值最高，为6.86，显著高于健康植株(6.61)；其他级死皮植株与健康植株差异不显著(图3A)。在乙烯利过度刺激采胶过程中，随植株死皮等级增加，胶乳黄色体破裂指数逐步升高，其中2～5级死皮植株的胶乳黄色体破裂指数均显著高于健康植株。4和5级死皮植株的胶乳黄色体破裂指数接近，为40%左右，约是健康植株(24.8%)的1.6倍(图3B)。

图3 不同死皮等级橡胶树的胶乳pH值(A)和黄色体破裂指数(B)差异Fig.3 Differences in pH (A)and lutoid bursting index (B)of latex from rubber trees with different grades of tapping panel dryness (TPD)

2.4 不同死皮等级橡胶树的胶乳硫醇和无机磷含量变化

在乙烯利过度刺激诱导橡胶树死皮的发展过程中，2～3级死皮植株的胶乳硫醇含量逐步上升，均显著高于健康(0级)植株。其中，3级死皮植株含量最高，为0.37 mmol·L-1；4～5级死皮植株含量则逐渐回落，与健康植株无显著差异(图4A)。胶乳无机磷含量以2级死皮植株最高，为40.3%，是健康植株(19.0%)的2.1倍；2～5级死皮植株的逐渐下降，其中5级死皮植株与健康植株无显著差异，但3和4级死皮植株均显著高于健康植株(图4B)。

图4 不同死皮等级橡胶树的胶乳硫醇(A)和无机磷(B)含量差异Fig.4 Differences in thiol (A)and inorganic phosphorus (B)contents of latex from rubber trees with different grades of tapping panel dryness (TPD)

2.5 不同死皮等级橡胶树的胶乳橡胶粒子大小

在乙烯利过度刺激诱导橡胶树死皮的发展过程中，各等级死皮植株的胶乳橡胶粒子粒径变化在0.09～2.27 μm 范围，呈单峰分布(图5)。同健康(0级)植株相比，2～5级死皮植株向小粒径方向偏移，且峰值下降；死皮等级越高，偏移越多，峰值越低。健康植株的胶乳橡胶粒子粒径在1.08 μm达到峰值，频度约为18.5%；2级死皮植株峰值偏移至0.94 μm，频度降至17.0%；5级死皮植株峰值偏移至0.88 μm，频度仅为16.4%。2～5级死皮植株胶乳橡胶粒子的平均粒径均显著低于健康植株，且随死皮等级增加而逐步减小。健康橡胶树胶乳橡胶粒子的平均粒径为0.89 μm，而5级死皮植株的降至0.79 μm(图6)。这表明，在乙烯利过度刺激诱导橡胶树死皮的发展过程中，胶乳橡胶粒子逐渐变小。

图5 不同死皮等级橡胶树的胶乳橡胶粒子粒径分布差异Fig.5 Differences in size distribution of latex rubber particles from rubber trees with different grades of tapping panel dryness (TPD)

图6 不同死皮等级橡胶树的胶乳橡胶粒子平均粒径差异Fig.6 Differences in average size of latex rubber particle from rubber trees with different grades of tapping panel dryness (TPD)

3 讨论

乙烯利刺激能显著提高橡胶树胶乳产量，因而生产中广泛应用，适宜的乙烯利浓度一般能使产量提高1.5～2倍(Pujade-Renaudetal.,1994)。本研究采用的高浓度乙烯利，增产效果更明显。在高浓度乙烯利采胶早期阶段，胶乳产量提高达3～4倍，但并不能持续太久。橡胶树对乙烯利刺激强度有一定忍受范围，超过范围后死皮会明显增加(许闻献等，1995)，本研究中约在第26割次之后，死皮迅速发生发展，胶乳产量开始下滑，由最初的显著增产变为明显减产。仅4个月左右的乙烯利过度刺激采胶便导致高达93.75%的植株发生不同程度的死皮。由此可见，乙烯利过度刺激采胶会快速诱发橡胶树死皮。因此，生产上应合理使用乙烯利，严格控制刺激强度，以免变利为害。

乙烯利过度刺激导致橡胶树死皮的机制目前仍不十分清楚(袁红梅等，2015；Montoroetal.,2018)，为此，本研究探究了橡胶树死皮的生理效应。在乙烯利过度刺激诱导橡胶树死皮过程中，胶乳干胶和可溶性固形物含量均在0～3级死皮植株中逐步下降，在4～5级死皮植株中逐步回升。高浓度乙烯利刺激会促进水分输入乳管，产生稀释效应，即导致胶乳干胶含量和可溶性固形物含量的降低(范思伟等，1991；许闻献等，1995；仇键等，2014；杨文凤等，2017)。在乙烯利过度刺激采胶初期，胶乳强烈稀释，排胶时间延长，胶乳排出量大幅增加，水分随之流失严重，导致树体水分发生不正常波动，这可能死皮的主要因素之一。树体水分波动一方面会导致植株生理失衡，代谢紊乱，另一方面会引起渗透压改变，导致黄色体破裂(许闻献，1984；1995；曹建华等，2008；位明明等，2016)。在乙烯利过度刺激下橡胶树发生3级死皮之前，由于乙烯利的强稀释效应，呈现出死皮植株的胶乳干胶和可溶性固形物含量低于健康植株的现象。在强乙烯利刺激下，过度排胶造成水分大量流失，树体水分不能及时补充，稀释效应逐渐降低，故呈现出4～5级死皮植株中含量逐步回升的趋势。在过度采胶情况下，过低的胶乳干胶和可溶性固形物含量时橡胶树有发生死皮的风险(肖再云等，2009)，因此可作为“警戒指标”。当其值明显偏低时，应降低乙烯利刺激强度或割胶频率，以利于树体调整恢复，维持产胶与排胶的动态平衡，避免死皮发生。

高浓度乙烯利刺激采胶引起排胶面的胶乳强烈稀释，渗透压显著下降，会导致对渗透压敏感的黄色体等细胞器破裂(许闻献，1984)。本研究也发现乙烯利过度刺激诱发的死皮植株胶乳黄色体破裂指数显著增加，且随死皮等级增加而增大。死皮橡胶树的胶乳黄色体完整性受到破坏，黄色体破裂指数升高(覃宝祥等，2005；郭秀丽等，2016；何晶等，2018)，其值越大表明胶乳越不稳定，越容易凝固堵塞从而使胶乳停排(肖再云等，2009；程成等，2012)。黄色体的破裂与橡胶树死皮发生有直接关系，黄色体中含有较高浓度的阳离子(Ca2+和Mg2+等)、阳离子蛋白和凝聚素等物质(肖再云等，2009；Gidroletal.,1994)。当黄色体破裂后，这些带正电荷的物质释放，并通过电荷中和作用使带负电荷的橡胶粒子凝集、凝固，堵塞乳管伤口，使排胶受阻，甚至停排，表现出死皮症状(Gidroletal.,1994；覃宝祥等，2005；史敏晶等，2016)。

无机磷含量是反映橡胶树乳管系统能量代谢强度的重要指标，无机磷含量高，表明乳管内能量代谢活跃(肖再云等，2009)。Putranto等(2015)和郭秀丽等(2016)的研究发现，死皮橡胶树胶乳无机磷含量显著低于健康树，但本研究和何晶等(2018)的研究表明，胶乳无机磷含量随死皮等级提高呈递减趋势，但均高于健康植株。乙烯利刺激会提高胶乳的无机磷含量，且无机磷含量与乙烯利浓度呈正相关(曹建华等，2008；王岳坤等，2014；杨文凤等，2017)。在用高浓度乙烯利刺激后，胶乳再生与能量代谢旺盛，胶乳产量及无机磷含量大幅增加，但由于大量无机磷随胶乳流出，树体不能及时补充，势必导致树体养分亏缺，促使死皮发生，并伴随发生胶乳无机磷含量逐步下降。以上结果表明，死皮发生会使植株能量代谢强度降低，且死皮越严重时降低越多。在高浓度乙烯利刺激和死皮的双重影响下，胶乳无机磷含量呈现出本研究中的变化趋势；如停止使用乙烯利，刺激效应消失，应会呈现与郭秀丽等(2016)研究一致的变化，即随着死皮等级提高，胶乳无机磷含量递减，且均显著低于健康植株。

橡胶粒子作为橡胶树乳管细胞中的一种特殊细胞器，是橡胶生物合成和贮存的主要场所，约占乳管细胞胶乳的30%～45%(吴华玲等，2009；史敏晶等，2016)。橡胶树橡胶粒子的形状有球形、卵形和梨形，粒子直径分布在0.08～2 μm，平均直径1 μm左右(Ohyaetal.,2000；Woodetal.,2000)。健康植株的胶乳的橡胶粒子粒径在0.08～2.27 μm之间，呈单峰分布，平均粒径为0.89 μm，与上述研究基本一致。同健康植株相比，死皮植株的胶乳橡胶粒子粒径分布向小粒径偏移，峰值降低，平均粒径减小。橡胶生物合成是在橡胶粒子膜上进行，死皮植株橡胶粒子变小，减少了橡胶粒子膜的总表面积和贮存空间，这可能会降低橡胶生物合成效率，从而导致死皮植株胶乳产量明显降低。死皮等级越高，产量越低，橡胶粒子也越小，表明橡胶粒子大小与死皮呈负相关。在乙烯利过度刺激采胶过程中，橡胶粒子变小可能是诱导死皮发生的一个重要因素。

4 结论

乙烯利过度刺激能显著提高橡胶树的胶乳产量，但会快速诱发死皮，最终导致产量下降。在天然橡胶生产中，应严格控制乙烯利刺激浓度，避免诱发死皮和因此变利为害。在乙烯利过度刺激采胶诱导橡胶树死皮的发生发展过程中，大量水分、无机磷和抗氧化剂硫醇随胶乳流出，导致树体养分亏缺及黄色体破裂，堵塞乳管，排胶受阻，表现出死皮症状。黄色体破裂与乙烯利过度刺激诱发的死皮直接相关。在死皮发生发展过程中，胶乳的橡胶粒子粒径分布向小粒径方向逐步偏移，峰值和平均粒径逐渐减小，减少了橡胶生物合成和贮存的空间，导致胶乳产量随死皮加重而越来越低。