木糖选择系统下xylA &BADH双价基因对二色胡枝子的遗传转化

杨晓红 陈晓阳

(1.北京农学院园林学院 北京 102206； 2.华南农业大学林学院 广州 510642)

运用基因工程技术实现植物性状的遗传改良已经成为培育植物新品种的一种趋势。在植物转基因中，采用有效的选择系统是植物转基因成功与否的一个关键环节。目前多数植物转基因采用除草剂选择系统和抗生素选择系统，但这2种选择系统的采用却是引发公众对转基因生物安全性关注的一个重要原因。因此，培育具有安全性的基因工程植株对加快转基因植物的商品化生产具有重要意义(叶纨芝等，2000)。以糖代谢途径中的一些酶基因(如木糖异构酶基因、磷酸甘露糖异构酶基因)作为转基因植物选择标记的正筛选系统是解决转基因生物安全性问题的一种有效途径(Haldrupetal.，2001)。

木糖异构酶(xylose isomerase，简称xylA)，又名葡萄糖异构酶，该酶不仅能够催化木糖代谢途径中从木糖到木酮糖的转化，而且能够催化果糖和葡萄糖的异构化，是食品工业上利用淀粉制备高果糖浆的关键酶，同时也是利用植物材料生产乙醇的重要酶类，被广泛应用于食品加工业和工业酿酒(Van Marisetal.，2008；Mertetal.，2017;Sathyaetal.，2020)。木糖异构酶基因(xylA)广泛存在于许多原核生物基因组中，在多数植物组织中呈现弱表达现象(Haldrupetal.，1998a；1998b)。大多数植物不能利用木糖但可以利用木酮糖，因此可以利用木糖作为这些植物遗传转化中的选择剂(Haldrupetal.，2001)。这种以xylA作为选择标记基因的木糖选择系统是公认的一种安全有效的选择系统(Mikietal.，2004)。不同于抗生素选择系统和除草剂选择系统中杀死非转基因细胞，在木糖选择系统中，转基因细胞能够利用木糖作为碳源维持生长分化，而非转基因细胞则因不能利用木糖而处于饥饿状态，最后死亡，因此这种选择系统也称为正向选择系统(Haldrupetal.，2001)。目前已经获得了经木糖筛选的烟草(Nicotianatabacum)(Danielletal.，2001)、马铃薯(Solanumtuberosum)(Liliusetal.,2000；Haldrupetal.,2001；Ewaetal.,2003)、番茄(Solanumlycopersicum)(Haldrupetal.，2001)、百脉根(Lotuscorniculatus)(韦正乙，2007)、玉米(Zeamays)(郭新梅等，2007)、花生(Arachishypogaea)(丁霄等，2012)等转基因植株，这些转基因植株中的xylA均来自原核生物。Kristo等(1996)首次从真核生物——大麦(Hordeumvulgare)中克隆出了xylA，后来赵建华等(2019)也从宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)中克隆出该基因，这为今后利用来自植物的木糖异构酶基因开展基因工程研究创造了条件。尽管以xylA作为选择标记基因的研究较多，但是，主要集中在草本植物中，对木本植物的研究还未见报导，而且该基因导入对植物体内糖代谢的影响方面的研究也很少，需要增强这方面的研究工作。

甜菜碱是一种广泛存在于植物、动物、微生物细胞中的可溶性化合物(Rhodesetal.,2003；Takabeetal.,2006；Chenetal.,2008)，是一种具备渗透调节作用的小分子物质，具有调节细胞渗透势、保护蛋白质结构和代谢酶活性、保护细胞膜等功能(McNeiletal.，1999)。高等植物的甜菜碱合成途径很简单，首先在胆碱单氧化酶(CMO)的作用下将胆碱生成甜菜碱醛，再在甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)作用下形成甜菜碱(Sakamotoetal.，2000；Chenetal.，2011)。许多研究表明转入甜菜碱醛脱氢酶基因可促进植物对甜菜碱的积累，提高植物耐盐性、抗旱性、耐寒性、耐热性、抗重金属毒性(Chenetal.,2008)。

二色胡枝子(Lespedezabicolor)是一种良好的水土保持树种和饲料植物，具有多种利用价值(杨晓红等，2019)。但是二色胡枝子只能在轻盐碱立地上生长，在高盐碱生境中不能存活(穆永光，2007)。为了进一步提高二色胡枝子的耐盐性和抗旱能力，培育出能够被公众接纳的转基因新品种，本试验以木糖为选择剂，对二色胡枝子进行xylA&BADH双价基因的遗传转化，以期培育出耐非生物胁迫能力更强且安全的二色胡枝子新品种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以二色胡枝子的子叶节为试验材料，种子来源于美国乔治亚州。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404和EHA105、pBI121植物表达载体、来源于山菠菜(Atriplexhortensis)的BADH由北京林业大学的林木花卉遗传育种教育部重点实验室保存；大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α由北京农学院生物技术学院实验室惠赠；引物合成和测序由上海生工完成；试验中用到的限制性核酸内切酶BamHⅠ、SacⅠ、ClaⅠ、NheⅠ、ApaⅠ为TakaRa公司产品；T4 DNA连接酶、DNA聚合酶为Promega公司产品；甜菜碱醛、抗生素为Sigma公司产品；Southern杂交试剂盒为北京美莱博医学科技有限公司产品；PUCm-T载体由上海生工提供；其他试剂由国内公司提供。

1.2 xylA的克隆和序列分析

根据GenBank中大肠杆菌的xylA序列，设计1对引物，在上游引物中加入BamHⅠ酶切位点，下游引物中加入SacⅠ酶切位点。上游引物(X1)为：5′-CGGGATCCATTATGGAGTTCAATATGC-3′，下游引物(X2)为：5′-TCGAGCTCTTATTTGTCGAAC AGATAATGG-3′。利用pfu DNA聚合酶采用PCR扩增的方法从大肠杆菌中克隆出xylA片段，并将片段插入PUCm-T载体中进行测序分析。PCR扩增条件：95 ℃变性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸3 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，0～4 ℃保存。

1.3 植物表达载体pBI121-xylA-BADH的构建

将测序分析正确的xylA片段用BamHⅠ、SacⅠ酶切后插入到进行了相同酶切的pBI121植物表达载体上，取代pBI121中的gus基因，构建成pBI121-xylA植物表达载体。用1对引物：上游3B(带有NheⅠ酶切位点)、下游BN(带有ClaⅠ酶切位点)，采用PCR技术从实验室保存的pBI121-BADH植物表达载体中扩增出35S-BADH-nos片段，扩增时利用保真度较高的Taq Platinum DNA聚合酶进行PCR反应。PCR扩增产物插入到PUCm-T载体中进行测序分析，将测序分析正确的35S-BADH-nos片段经NheⅠ、ClaⅠ双酶切后插入到进行了同样双酶切的pBI121-xylA植物表达载体中，取代pBI121-xylA载体中的nos-P-nptⅡ-nos-T序列，构建成植物表达载体pBI121-xylA-BADH。引物3B序列为：5′-AAAGCTAGCTCT TCGTCAACATGGTGGAGC-3′；引物BN序列为：5′-ATATCGATGGCCAGTGAATTCCCGATCT-3′(其中GCTAGC为NheⅠ酶切位点，ATCGAT为ClaⅠ酶切位点)。BADH基因用引物B1:5′-CCAGGTCTAGA ATGGCGTTCC-3′，引物B2:5′-TTTTCAAGGAGACT TGTACCA-3′检测。经过验证将构建正确的植物表达载体pBI121-xylA-BADH通过液氮冻融法分别转入到根癌农杆菌菌株LBA4404、EHA105中。35S-BADH-nos片段扩增条件为：94 ℃变性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，0～4 ℃保存。

1.4 以木糖为选择剂的二色胡枝子的遗传转化体系的建立

1.4.1 木糖对二色胡枝子组织分化的敏感性试验根据Haldrup等(1998a；1998b)对烟草和番茄的研究结果，在二色胡枝子遗传转化中，用木糖取代一定量的蔗糖来研究木糖对二色胡枝子分化、增殖和生根的影响。试验设计4种处理：1)蔗糖15 g·L-1+木糖15 g·L-1；2)蔗糖10 g·L-1+木糖20 g·L-1；3)蔗糖5 g·L-1+木糖25 g·L-1；4)蔗糖0 +木糖30 g·L-1。除糖源外，二色胡枝子子叶节分化培养基：MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 琼脂6 g·L-1；茎段增殖培养基为：MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 琼脂6 g·L-1；生根培养基为：MS*+ NAA 0.1 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1+ 琼脂6 g·L-1。每处理接种25个材料左右，重复3次，接种6～8周后观测二色胡枝子的子叶节、茎段在含有不同碳源培养基上的组织分化状况。最终根据试验结果确定木糖选择系统中的木糖添加量。MS*为仅大量元素减半的MS培养基。

1.4.2 二色胡枝子遗传转化 先将二色胡枝子的种子播种在MS培养基上，待其萌发后切除顶芽、胚根，并在2个子叶的中间部位纵切一刀，即将子叶节部位划伤，然后把材料接种在MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 琼脂6 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1培养基上，预培养时间设为0、12、24、48 h。在方法1.4.1及预培养时间筛选的基础上，采用L4(23)正交设计，研究载体菌株类型、农杆菌侵染时间、共培养时间对二色胡枝子子叶节遗传转化的影响。载体分别为LBA4404、EHA105两种根癌农杆菌菌株，侵染时间为20 min和30 min，共培养时间为2天和3天。遗传转化时，外植体预培养1天，菌液浓度的OD600值约为0.6，菌液中加入100 μmol·L-1的乙酰丁香酮；用无菌滤纸轻轻吸干外植体上的菌液，再把植物材料接种在MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 琼脂6 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1培养基上，在黑暗条件下使农杆菌与外植体共培养2～3天；最后把共培养后的子叶节材料接种在MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 琼脂6 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 头孢霉素200～300 mg·L-1培养基上进行选择培养。8～10周后观察结果。获得的木糖抗性芽接种在MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1+ 琼脂6 g·L-1+ 木糖 25 g·L-1+ 蔗糖5 g·L-1+ 头孢霉素200 mg·L-1的培养基上进行选择性增殖培养，增殖后的抗性芽于MS*+ NAA 0.1 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1+ 琼脂6 g·L-1+ 木糖 25 g·L-1+ 蔗糖 5 g·L-1+ 头孢霉素 150 mg·L-1的培养基上进行选择性生根。

1.5 转基因二色胡枝子的PCR和Southern检测

转基因和非转基因植株的总DNA提取采用CTAB法。用BADH的1对特异引物B1、B2进行PCR检测。植物DNA先用ApaⅠ进行酶切，琼脂糖电泳分离酶切产物，再转移到带正电荷的尼龙膜上，用地高辛标记的BADH片段作为探针，按照Southern杂交试剂盒上的操作方法进行Southern检测。

1.6 转基因植株的耐盐性试验及盐胁迫下的叶绿素、电导率、甜菜碱醛脱氢酶活性

将经过分子检测的转基因植株和对照植株分别接种到含有0.5、1.0、1.5、2 g·L-1NaCl的生根培养基上，观察转基因植株的耐盐性表现。

叶绿素测定采用丙酮法，用DDS-307型电导率仪测定电导率。甜菜碱醛脱氢酶活性测定参照解小娟等(2013)的方法。

1.7 转基因植株及对照叶片中可溶性木糖、葡萄糖、果糖测定

取繁殖数量相对较多的一个转基因株系及对照材料的组培苗叶片0.5 g(非逆境胁迫下)，剪碎后放入玻璃试管中，加水10 mL，沸水浴30 min，冷却后，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，再用碳18柱过滤以去除色素等杂质，将滤液浓缩到2 mL，取100 μL用美国Waters公司高效液相色谱仪(型号：Sugar analyzer I，色谱柱为 Sugar-Park TM 1，流动相为超纯水)分析可溶性木糖、葡萄糖、果糖含量。

2 结果与分析

2.1 xylA基因的克隆和pBI121-xylA-BADH植物表达载体的构建

从大肠杆菌中扩增出与预估片段大小吻合的长约1 300～1 400 bp的片段，并送交上海生工进行测序。测序结果(图1A)经过与GenBank公布的大肠杆菌xylA核苷酸序列进行比对，选定的目标DNA片段的核苷酸序列与xylA(NCBI-TaxID=526，Parent Accession：K01996.1)的同源性达到了100%，表明xylA被准确地从大肠杆菌中克隆出来。

从pBI121-BADH植物表达载体中扩增出35S-BADH-nos片段，将该片段插入到pUCm-T载体，构建成pUCm-35S-BADH-nos载体后进行测序，测序结果(图1B)表明所扩增产物与公布的核苷酸序列同源性为100%。再用xylA取代pBI121植物表达载体中的gus基因，构建植物表达载体pBI121-xylA，经PCR检测，表明所构建载体正确(图1C)。用限制性核酸内切酶NheⅠ和ClaⅠ对pUCm-35S-BADH-nos载体和pBI121-xylA载体进行双酶切，用35S-BADH-nos片段取代pBI121-xylA载体中的nos-P-nptⅡ-nos-T序列，构建成植物表达载体pBI121-xylA-BADH，经PCR检测和用限制性核酸内切酶BamHⅠ酶切检测(图1D)，证实所构建载体正确，获得了植物表达载体pBI121-xylA-BADH(图1E)。

2.2 木糖对二色胡枝子组织分化的影响

试验控制总糖含量为30 g·L-1，配制培养基时用木糖取代部分或全部蔗糖来研究木糖对二色胡枝子子叶节分化、茎段增殖、生根的影响。结果(表1)显示，二色胡枝子在子叶节分化、茎段增殖、组培苗生根过程中，基本上不能利用木糖作为组织分化过程中的唯一碳源。在子叶节分化中，虽然观测到个别材料能在纯木糖培养基上分化出不定芽，但是经过一段时间后该芽会死亡。二色胡枝子组织分化能力受培养基中木糖含量影响(表1)。当培养基中木糖含量25 g·L-1、蔗糖5 g·L-1时，52%的子叶节能够分化出不定芽，但是茎段无法分化出不定芽，材料也不能生根；当培养基中木糖含量20 g·L-1、蔗糖10 g·L-1时，二色胡枝子子叶节的分化能力明显增强，有68%的子叶节分化出不定芽，平均每个子叶节分化出的不定芽数为0.3，达到对照的7%，但是茎段分化率和生根率仍然较低；当培养基中的木糖、蔗糖含量均为15 g·L-1时，子叶节分化率能够达到90%，茎段分化率和生根率也分别达到对照的23.4%和45.7%，而且每个子叶节平均能分化出0.9个不定芽。由此可见，当培养基中的碳源用木糖取代蔗糖时，木糖取代量越大，对各类组织分化的影响越大，培养基中蔗糖含量越少，各类组织的分化能力越低。因此，当以木糖为选择剂对二色胡枝子进行遗传转化时，应在纯木糖培养基上筛选抗性芽，而在抗性芽增殖和生根过程中，可采用木糖25 g·L-1、蔗糖5 g·L-1的混合糖剂进行筛选。

表1 木糖对二色胡枝子子叶节再生、茎段分化及组培苗生根的影响①Tab.1 Effects of xylose on the regeneration of adventitious buds from cotyledonary node,shoot segment multiplication and rooting ability in vitro

2.3 预培养时间、菌种、侵染时间和共培养时间对转化效果的影响

预培养时间对二色胡枝子遗传转化影响见表2。不进行预培养的处理得不到木糖抗性芽，预培养12 h和24 h的处理均得到2个能再生的抗性芽，而预培养48 h的处理只得到了1个能再生的抗性芽。因此在二色胡枝子遗传转化中，预培养时间适合采用12～24 h。采用L4(23)正交设计，研究载体菌株类型、农杆菌侵染时间、共培养时间对二色胡枝子子叶节遗传转化的影响，结果见表3。对二色胡枝子进行遗传转化时，LBA4404(Oct型)菌株的转化效果要好于EHA105(Nop型)菌株，在纯木糖选择压下，LBA4404菌株平均获得的抗性芽再生率可达5.85%，而EHA105菌株平均获得的抗性芽再生率只有1.8%。采用LBA4404菌株分别侵染20 min和30 min，均可获得能够再生的抗性芽。利用农杆菌进行遗传转化时，共培养3天的效果好于共培养2天。

表2 预培养时间对转化效果的影响①Tab.2 Effect of pre-culture on transformation frequencies

表3 菌种、侵染时间和共培养时间对转化效果的影响Tab.3 Effects of bacterium strains,infection time and cocultivation time on transformation frequencies

2.4 转基因植株的PCR和Southern检测

用木糖作选择剂，对278个子叶节外植体进行农杆菌介导的遗传转化，获得了木糖抗性芽(图2)13个，抗性芽获得率为4.7%。随机选取4个繁殖数量相对较多的木糖抗性株系，对BADH基因进行PCR检测，产物凝胶电泳结果(图3a)表明，随机选取的这4个转化株系和阳性质粒都扩增出了大约1 520 bp的特异性条带，而阴性对照则未见条带，初步表明有可能获得二色胡枝子的转基因植株。

图2 xylA &BADH转化后的木糖抗性芽Fig.2 The xylose-tolerant buds transformed with xylA &BADH a:转化后20天;b:转化后45天。a:20 d after transformation;b:45 d after transformation.

经分析，在pBI121-xylA-BADH质粒的T-DNA区段的核苷酸序列中没有ApaⅠ酶切位点。将4个转基因株系及对照的DNA经ApaⅠ酶切后，其Southern杂交结果见图3b。质粒阳性对照的酶切产物出现了1条杂交带，2号、4号转化株系各显示出1条杂交带，而1号、3号转化株系以及阴性对照未见杂交信号，表明BADH基因被单拷贝插入到2号、4号这2个转化株系的基因组中。

图3 转xylA &BADH基因植株的BADH的PCR和Southern检测Fig.3 PCR amplification and Southern blot analysis for BADH of xylA &BADH transgenic plantsa:PCR检测(1 520 bp);b:Southern检测。M:DNA marker;CK+:质粒;CK-:未转化植株;1-4:转化植株。a:PCR analysis(1 520 bp);b:Southern blot analysis.M:DNA marker;CK+:Plasmid;CK-:Wild-type plants;1-4:Putative transgenic plants.

2.5 NaCl胁迫对转基因植株组培苗的影响

将经过分子检测和扩繁的2个转基因株系与对照植株接种到含有不同盐浓度的生根培养基上，生长1个月后观察发现：在0.5 g·L-1NaCl胁迫下，转基因植株与非转基因植株的生长表现没有明显差别，但是随着盐浓度的加大，二者在耐盐性上有了明显差异，2个转基因株系植株在含有2 g·L-1NaCl的培养基上均能够正常生长，并分化出根系，而非转基因植株在含有2 g·L-1NaCl的培养基上表现出叶片变黄脱落，不能分化出根系等现象(图4)。

图4 2 g·L-1 NaCl对二色胡枝子转基因及对照植株的影响Fig.4 The effect of 2 g·L-1 NaCl on transgenic and wild-type L. bicolora:生长在含有2 g·L-1 NaCl培养基上的xylA &BADH转化植株;b:生长在含有2 g·L-1 NaCl培养基上的非转基因植株;c:在含有 2 g·L-1 NaCl培养基上的转基因植株(左)与非转基因植株(右)生根情况。a:xylA &BADH tansgenic plant on the medium contained 2 g·L-1 NaCl;b:Wild-type plants on the medium contained 2 g·L-1 NaCl;c:Rooting of transgenic plant (left)and wild-type plants (right)on the mediums contained 2 g·L-1 NaCl.

对生长于1 g·L-1NaCl培养基上的转基因材料与对照材料进行叶绿素含量、电导率及甜菜碱醛脱氢酶(BADH)活性测定，结果(表4)显示，在未进行盐处理前，2个转入xylA&BADH基因的二色胡枝子株系中的BADH酶活性与非转基因的对照植株没有明显差异；经盐处理1个月后，非转基因植株的BADH酶活性没有明显变化，而转基因植株的BADH酶活性得到了较大幅度的提升，并达到对照植株的8～10倍。盐处理前，转基因与非转基因植株的叶绿素含量、电导率也不存在显著性差异，但是经过盐处理后，转基因植株的叶绿素含量明显高于非转基因植株，而电导率则明显低于非转基因植株。上述结果表明：外源BADH基因导入二色胡枝子后能够发挥相应功能，从而提高转基因植株的耐盐性。

表4 NaCl胁迫对转xylA &BADH基因二色胡枝子生理指标的影响Tab.4 Effects of NaCl stress on physiological indexes of xylA &BADH transgenic plants

2.6 外源基因导入对植株叶片中可溶性木糖、葡萄糖、果糖的影响

用高效液相色谱仪分析转基因植株与对照叶片中的可溶性糖成分及含量，结果(图5)发现非转基因的二色胡枝子组培苗叶片中仅测出了葡萄糖(保留时间为17.5 min)，且每克鲜叶中含量为1.218 mg，未检测出木糖(保留时间为15.0 min)和果糖(保留时间为16.3 min)；转基因植株组培苗的叶片中则测出了果糖和葡萄糖，其中果糖含量为0.623 mg·g-1，葡萄糖含量为0.662 mg·g-1，未检测出木糖。此外，在非转基因植株中还测出了另一种未标定的单糖成分(其保留时间为18.76 min)。

3 讨论

在植物转基因研究中，多利用xylA作为选择标记基因，以木糖为选择剂，而有关木糖异构酶基因在植物中对糖代谢影响研究则相对较少。Lilius等(2000)对转入热稳定性葡萄糖异构酶(也叫木糖异构酶)基因的马铃薯进行研究时发现，田间生长的转基因马铃薯中的果糖含量比非转基因材料高。本研究用来自大肠杆菌的xylA作为选择标记基因对二色胡枝子进行研究发现，转基因组培苗叶片中能测定出果糖和葡萄糖，而非转基因的同类材料只能测定出葡萄糖，测不出果糖，进一步表明木糖异构酶能促进植株内葡萄糖与果糖的异构化。此外，研究中利用高效液相色谱还在二色胡枝子的非转基因材料中测出了一种保留时间为18.76 min的糖成分，由于试验中仅标记了木糖、葡萄糖、果糖，该糖名称不确定。Ewa等(2003)研究发现，表达来自大肠杆菌xylA的转基因马铃薯块茎中一种己糖成分发生了改变，从而影响了器官的新陈代谢。本研究中，转基因的二色胡枝子所转入的基因也有来自大肠杆菌的xylA，该基因的表达可能影响了植株内的糖代谢，才使得转基因材料与非转基因材料测出了不同类型的糖成分。

Haldrup等(2001)研究认为，以糖代谢中的一些酶基因作为转基因植物选择标记的正筛选系统可获得比负选择系统更高的遗传转化率。以玉米、马铃薯和紫花苜蓿(Medicagosativa)以农杆菌介导的遗传转化为例，以甘露糖为选择剂时，三者转入磷酸甘露糖异构酶基因的遗传转化率分别为30%(Negrottoetal.，2000)、53.3%(Bízaetal.，2008)、39.6%(王婷等，2008)，而抗生素选择系统在优化条件下的遗传转化率分别为30%(Ishidaetal.，1996)、36.8%(张宁等，2004)、30%(谢鑫星等，2010)。以上结果说明以磷酸甘露糖异构酶基因作为选择标记基因的糖类选择系统可以获得比抗生素选择系统更高的遗传转化率。而以木糖为选择剂，以木糖异构酶基因作为选择标记基因的遗传转化中，不同材料的遗传转化效率表现不同。马铃薯和番茄的木糖选择系统的遗传转化效率高于其抗生素选择系统，而烟草的木糖选择系统的遗传转化效率低于其抗生素选择系统(Haldrupetal.，2001)。在农杆菌介导的花生遗传转化研究中，以木糖为选择剂，对花生的胚小叶外植体进行遗传转化，其木糖选择系统的遗传转化率在11.2%～11.7%(丁霄等，2012)，而花生胚小叶的抗生素选择系统在优化条件下的瞬时转化率为12%～36%(Egninetal.，1998)；当以浸泡吸水后的花生半粒种子为转化受体，以除草剂为选择剂时，遗传转化率可高达69.03%(朱军等，2018)。这些研究表明花生的抗生素或除草剂选择系统的遗传转化效率高于木糖选择系统。本研究中，二色胡枝子子叶节外植体的木糖选择系统的抗性芽获得率为4.7%。随机选出的4个繁殖数量较多的木糖抗性株系的PCR结果显示均可扩增出目的基因片段。假定其他未检测的抗性株系均可通过PCR检测，本次试验的二色胡枝子木糖选择系统的遗传转化率最高只能达到4.7%，而同样转化方法的二色胡枝子抗生素选择系统的遗传转化率为2%(黄天伟，2009)，说明二色胡枝子的遗传转化效率还比较低，其遗传转化方法有待于进一步提高。

许多细胞相溶性物质能提高植物对逆境的适应能力，甜菜碱就是其中研究最多的一种物质。甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是甜菜碱合成中的关键酶，转BADH植物中积累甜菜碱提高了植物对各种逆境的适应能力(Chenetal.，2011)。本次对转入BADH的二色胡枝子的研究显示：转基因植株能够提高盐胁迫下BADH酶活性，降低盐胁迫下叶片的电导率和维持较高的叶绿素含量。这个结果进一步证实转入BADH确实能提高植物对逆境的适应能力。

PCR检测和Southern检测是对转基因植株进行分子检测中最常用的技术手段。PCR技术虽然具有敏感性高、操作简单迅速、对样品纯度要求不高等优点，但也存在容易产生非特异性扩增、不能阐明外源基因在植株内的整合状况等缺点(Erlich，1989)。Southern杂交技术是当前鉴定外源基因整合的权威方法，该法是以目的基因的DNA为探针与被检测植株的DNA进行杂交反应，因此要求DNA具备一定的纯度、长度和浓度，当杂交样品的DNA纯度不合格或浓度过低时，杂交常无信号(闫新甫等,2003)。本次试验中，因为不同株系的转基因材料扩繁速率不同，受繁殖材料限制，各个株系材料提取的植物总DNA浓度存在差异。对转基因株系进行PCR检测时，有4个株系扩增出了BADH条带，但是在Southern检测中则仅有2个株系出现了杂交条带。造成此种现象的原因可能有以下3方面：1)试验材料的DNA浓度达不到要求；2)提取植物总DNA的材料为组培苗，可能还携带一定数量的农杆菌；3)外源基因虽然进入了植株体内，但是并没有整合到植物的基因组。尽管通过Southern检测显示2号、4号这2个株系的杂交信号强弱不同(图3b)，但是通过对NaCl胁迫下2个转基因株系BADH酶活性测定结果分析，这2个转基因株系的BADH酶活性并不存在明显差异，也从另一角度说明这2个株系的外源基因拷贝数是相同的。造成2个株系的Southern检测信号差异的原因是因为进行图3b的Southern杂交检测时，受转化材料繁殖数量的限制，2个株系提取植物总DNA时材料用量不同，因而提取的DNA浓度存在差异，经ApaⅠ酶切后，从而在图3b的Southern杂交反应中显现出强弱不同的杂交信号带。

4 结论

测序结果表明从大肠杆菌中成功克隆出木糖异构酶基因，并正确构建了pBI121-xylA-BADH植物表达载体。当采用农杆菌介导法以木糖为选择剂对二色胡枝子进行遗传转化时，可以获得转入xylA&BADH双价基因的转基因植株。外源甜菜碱醛脱氢酶基因的导入能够提高二色胡枝子的耐盐性。来自大肠杆菌的外源木糖异构酶基因的导入，会影响二色胡枝子组培苗叶片内的糖代谢。